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登革热已成为全球性威胁，每年影响数百万人，并导致显著的死亡负担。在登革热流行地区，疫苗接种是预防该病最有效的方法。深入了解病毒生长动力学对于设计稳健且可扩展的疫苗生产工艺至关重要。本研究旨在优化四种重组活减毒登革血清型的关键生长参数，包括收获时间表、温度、感染
登革热已成为全球性威胁，每年影响数百万人，并导致显著的死亡负担。在登革热流行地区，疫苗接种是预防该病最有效的方法。深入了解病毒生长动力学对于设计稳健且可扩展的疫苗生产工艺至关重要。本研究旨在优化四种重组活减毒登革血清型的关键生长参数，包括收获时间表、温度、感染复数（MOI）和代谢物浓度。生长动力学数据以及后续的放大研究证实，在确定的生产窗口内，所有四种血清型均可实现多次收获，且首次收获最佳时间在感染后第4至第8天之间。所有血清型均表现出对低MOI和温度变化的强烈响应，在更短的时间内使滴度提高2至25倍。此外，代谢物分析揭示了谷氨酰胺和葡萄糖消耗的独特动态，凸显了其对于优化感染培养基的重要性。综上所述，这些发现为登革病毒生产提供了宝贵见解，并确定了关键参数，可为未来的优化研究和规模化生产提供支持。
**研究背景**
登革热是由登革病毒（DENV）引起的蚊媒传染病，全球每年约4亿人感染，近65%人口面临风险，尤其在美洲和亚洲的热带与亚热带地区。该病由四种血清型（DENV-1至DENV-4）引发，二次感染异型血清型后因抗体依赖性增强（ADE）可能加重病情。有效疫苗需同时诱导针对四种血清型的中和抗体，目前已有多种疫苗策略，但如Sanofi Pasteur的Dengvaxia?（基于黄热病毒骨架的嵌合活减毒疫苗）虽获许可，却因在9岁以下未感染儿童中增加重症风险而停产；Takeda的TAK-003（DENVax）对血清阴性个体保护力不足；美国国立卫生研究院（NIH）开发的TV003/TV005（基于Δ30/Δ31缺失的活减毒疫苗）在巴西完成III期试验并获批准。为满足全球需求，需将实验室规模生产放大至工业级别，其中关键参数包括感染复数（MOI）、培养温度、收获时间和代谢物浓度。本研究旨在系统优化这些参数，以建立高效、可扩展的DENV生产工艺。
**研究内容与结论**
研究人员在Vero细胞中系统评估了NIH开发的四种重组活减毒登革血清型（rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3Δ30/31、rDEN4Δ30）的复制参数，得出以下结论：生长动力学显示所有血清型在感染后第4–8天达到峰值滴度；多次收获策略（2天间隔）可在16天内持续获得高滴度病毒；低MOI（0.0001）与32°C培养温度组合可使滴度提升最高25倍并缩短生产周期；代谢物分析表明葡萄糖比谷氨酰胺更关键，其消耗贯穿感染全程。该研究发表在《Vaccine: X》上，为开发稳健、可规模化的DENV生产工艺提供了关键数据。
**主要技术方法**
研究使用Vero（WHO）细胞（ECACC，目录号88020401）和NIH/NIAID提供的四种重组活减毒登革病毒株。采用无血清OptiPRO? SFM培养基（含4 mM L-谷氨酰胺）维持病毒生产。关键方法包括：24孔板中的生长动力学研究（MOI 0.01，37°C，15天逐日取样）；5层细胞工厂中的多次收获试验（MOI 0.01，每2天收获至第16天）；MOI优化（0.01与0.0001比较，第6、8、10天收获）；温度优化（32°C与37°C，MOI 0.0001）；代谢物分析（每日检测葡萄糖和谷氨酰胺浓度至第8天）。病毒滴度通过空斑测定法（免疫染色）量化。
**研究结果**
**3.1 生长动力学研究**：所有四种重组DENV血清型（rDEN1–4）在Vero细胞中于感染后第2–3天开始复制，峰值滴度出现在第4–8天，其中rDEN1在第4天达6.74 log PFU/mL，rDEN2/4在第8天达6.23 log PFU/mL，rDEN3在第7天达6.22 log PFU/mL，rDEN4在第8天达7.09 log PFU/mL。这表明存在明确的生产窗口，且病毒可维持感染达15天以上。
**3.2 多次收获试验**：在16天培养期内，所有血清型均持续产生病毒。首次收获（第6天）后，滴度逐步升高。rDEN1在第10天达峰值6.77 log PFU/mL，rDEN2/4在第14天达6.72 log PFU/mL，rDEN3在第10天达6.49 log PFU/mL，rDEN4在第10天达7.11 log PFU/mL。结果证实每2天间隔的多次收获策略可行，且可累积更高病毒产量。
**3.3 MOI优化与多次收获**：比较MOI 0.01与0.0001对病毒产量的影响。rDEN1和rDEN4在早期（第6、8天）对高MOI更敏感，但到第10天差异不显著；rDEN2/4仅在第8天显著；rDEN3在整个过程中无显著差异。所有血清型在MOI 0.0001下仍能实现高产，最高滴度出现在第10天（rDEN1: 6.75, rDEN2/4: 6.12, rDEN3: 5.39, rDEN4: 7.02 log PFU/mL）。这表明低MOI（0.0001–0.01）可有效减少种子病毒用量而不影响最终产量。
**3.4 温度优化**：在MOI 0.0001下比较32°C与37°C。除rDEN3外，所有血清型在32°C下滴度显著更高。所有血清型在第8天达峰值（rDEN1: 8.17, rDEN2/4: 7.17, rDEN3: 6.85, rDEN4: 8.34 log PFU/mL），比37°C提前2天。与MOI优化相比，温度优化使峰值滴度提升2–25倍（rDEN1约25倍，rDEN4约20倍，rDEN2/4和rDEN3约10倍）。这表明降低温度可缩短生产周期并提高产量。
**3.5 培养基代谢物研究**：监测至第8天的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。谷氨酰胺在第2天后消耗急剧减少，而葡萄糖持续消耗至第8天，且第6天更换培养基后重新补充。尽管谷氨酰胺利用有限，病毒滴度仍持续上升。说明葡萄糖在支持DENV复制中比谷氨酰胺更关键，为优化感染培养基提供依据。
**讨论与结论**
研究系统优化了四种重组活减毒登革血清型在Vero细胞中的关键生产参数。生长动力学和多次收获试验表明，病毒可持续生产至第16天，且2天间隔收获策略效果良好。MOI优化显示极低MOI（0.0001）对大规模生产高效。进一步，结合低MOI与32°C温度转换可使总体病毒产量提升最高25倍并加速生产时间线。代谢物动态揭示感染周期中葡萄糖持续摄入而谷氨酰胺消耗有限，凸显葡萄糖优化的重要性。这些发现为开发稳健、可扩展的DENV生产工艺提供了关键见解，同时强调了血清型特异性优化的必要性，为未来疫苗生产策略优化（确保最大产量、一致性和成本效益）奠定了坚实基础。
