综述：包涵体在水产养殖和畜牧业疾病控制中的潜力

《Veterinary and Animal Science》：Potential of inclusion bodies for disease control in aquaculture and livestock

　　

包涵体（inclusion bodies, IBs）是不可溶的纳米结构重组蛋白，已成为动物生产中疾病控制的创新生物材料。本系统文献综述旨在探索包涵体在水产养殖和畜牧业疾病控制中的应用。研究人员在四个数据库（PubMed, Web of Science, Science Direct 和 Scopus）中进行了文献检索。在检索到的3,139篇研究文章中，只有16篇符合纳入标准：其中6篇涉及水产养殖，包括虹鳟、塞内加尔鳎和斑马鱼的研究；10篇涉及畜牧业，包括牛、羊、猪和小鼠模型的研究。这些研究中产生的蛋白质主要是宿主免疫系统蛋白和病原体抗原蛋白。在水产养殖中，可能通过包涵体控制的疾病或病原体包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）、鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus）和病毒性神经坏死病毒（Viral nervous necrosis virus）。相反，在畜牧业中，评估通过包涵体控制的疾病或病原体包括乳腺炎、肝片吸虫（Fasciola hepatica）、劳森氏胞内菌（Lawsonia intracellularis）和弧菌属（Vibrio sp.）。给药策略差异很大，包括乳腺内灌注、鼻腔悬浮液、胃内注射、食管插管、肌肉注射和口服给药。无论给药途径如何，这些生物材料始终通过两种机制激活免疫应答：通过免疫刺激蛋白调节宿主免疫系统，以及通过抗原蛋白激活适应性免疫。尽管前景广阔，但广泛采用仍受到技术挑战的限制，包括纯化标准化、批次变异性以及缺乏在商业相关物种中的研究。这些发现为基于包涵体（IB）的干预措施在动物健康中的发展提供了坚实的证据基础，并指导了未来的研究方向。

**3.1. IB Production: Proteins and Expression Systems**
在包涵体（inclusion bodies, IBs）生产中，产生的重组蛋白分为宿主特异性蛋白和病原体特异性蛋白。宿主特异性蛋白包括肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素1β（IL1β）、白介素6（IL6）、白介素8（IL8）、趋化因子（C-C基序）配体4（CCL4）和基质金属蛋白酶9（MMP9），这些蛋白作为免疫刺激剂，通过调节宿主免疫系统增强抗病能力。病原体特异性蛋白包括来自细菌（如劳森氏胞内菌（Lawsonia intracellularis）的外膜蛋白1c和2c（OMP1c/OMP2c）、弧菌属（Vibrio sp.）的外膜蛋白K（OmpK））、病毒（如病毒性神经坏死病毒（VNNV）的衣壳蛋白（CP）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的糖蛋白G（GP）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）的糖蛋白G）以及寄生虫（如肝片吸虫（Fasciola hepatica）的半胱氨酸蛋白酶和saposin-2（FhSAP2））的抗原蛋白，旨在激活适应性免疫记忆，发挥类似疫苗的作用。表达系统主要使用大肠杆菌（Escherichia coli）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris）。L. lactis 因具有公认安全（GRAS）状态且不产生内毒素，在畜牧业研究中更受青睐；E. coli 虽产量高，但其脂多糖（LPS）在哺乳动物中可引发强烈炎症反应，但鱼类由于低TLR4敏感性而对此耐受，因此E. coli 在水产养殖中也被广泛应用。

**3.2. Delivery Routes and Biodistribution**
包涵体（IBs）的给药途径多样，包括肌肉注射、皮下注射、鼻腔悬浮液、乳腺内灌注（在牛中）、腹腔注射、浸泡（在斑马鱼幼虫中）和口服（包括口腔插管和胃内注射）。这些生物材料具有显著的稳定性：冻干（-80°C 8小时后室温储存三周）后形态和大小不变，且生物活性保留；暴露于高温（100°C 30秒或5分钟）和极端pH（pH 2-10）后，扫描电子显微镜显示形态未改变，但需进一步评估生物活性。在鱼类中，口服灌注后IBs被肠道细胞吸收，并转运至头肾和脾脏等关键免疫器官；浸泡处理24小时内被内化。无论何种给药途径，IBs均能诱导免疫应答，但反刍动物因四室胃结构，口服可能降解抗原，而口服在猪中仍有效（如IB-IL1β在20 μg/kg剂量下，7天后TNFα水平显著升高）。乳腺内灌注MMP9-IBs后，酶活性在第3-6天达到峰值，牛血清白蛋白（BSA）和Na+/K+比值也升高，证实持续免疫激活。未来需根据物种生理和病原特性优化给药策略。

**3.3. Immunomodulatory Potential of IBs-Based Biomaterials**
包涵体（IBs）的疾病控制机制分为两类：宿主免疫蛋白直接调节免疫系统，病原体抗原蛋白激活适应性免疫。免疫应答评估主要基于细胞因子基因表达。例如，IB-IL1β显著刺激tnfα基因表达，而IB-TNFα上调tnfα、il6、il1β、il8、cox2、mmp9等基因；IB-TNFα在斑马鱼中不显著增加肠道和脾脏的tnfα，但上调il1β和il6。不同IB配方产生不同的基因表达谱，且剂量与基因表达呈非线性关系，如IB-TNFα在20 μg和5 μg时显著增加cathelicidin抗菌肽（camp1）基因表达，但10 μg时无变化；cox2表达与剂量正相关，而mmp9在5 μg时表达最佳。时间上，IB-TNFα在5小时上调il1β和cox2，但24小时则以mmp9和il6为主。长期效应方面，IB处理可加速嗜酸性粒细胞活化（牛中雌性早于雄性），并延迟但显著升高IgG水平（小鼠中第3周后）。性别差异显著：雌性牛对F. hepatica抗原的寄生虫计数降低更多，保护程度更高；而羔羊中无性别差异。这些结果强调剂量、时间和性别在IB介导的免疫调节中起关键作用。

**3.4. Protective efficacy: Pathogen Challenge and Survival**
在6篇评估生存率的研究中，所有均使用斑马鱼腹腔注射模型，并以相对存活百分比（RPS）衡量保护效力。IB-TNFα对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）攻击的RPS达100%，但对海分枝杆菌（M. marinum）仅为33.3%（30天）。抗原蛋白IB-SVCV单独使用RPS为50%，联合干扰素-γ（IFN）模块后升至80%（40天）。冻干后的IB-TNFα对P. aeruginosa的RPS更高（83%），优于未冻干组（62%）。在小鼠模型中，口服IBs对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的RPS为80%，皮下注射FhSAP2-IBs对F. hepatica的RPS也为80%。这些结果证实IBs能触发强效免疫应答，保护动物免受致死病原体攻击，但需在商业相关物种中进一步验证。

**3.5. Technological Challenges**
主要技术挑战包括纯化标准化和批次变异性。纯化过程中，基于大肠杆菌的表达系统可能残留脂多糖（LPS），需通过去除步骤或采用无LPS系统（如乳酸乳球菌、大肠杆菌突变株或酵母）解决。新兴的人工包涵体（artificial IB）通过体外组装纯化蛋白，完全避免内毒素污染，但额外步骤可能增加成本（约1/20其他蛋白药物）。批次变异性源于IBs形成受蛋白质理化特性（分子量、疏水残基）和培养条件（温度、pH）影响；低温形成的IBs溶解更快，pH影响β-构象形成淀粉样沉积。因此，需开发针对特定蛋白的优化策略，并利用人工智能工具（如AlphaFold、RoseTTAFold、ProtGPT2）预测聚合域，结合机器学习分析培养大数据，以最大化产量和纯度，实现规模化、成本效益高的生产。

**3.6. Future Perspectives**
重组蛋白市场预计从2022年的4.571亿美元增长至2032年的7.195亿美元，其中治疗性蛋白占近一半。IBs作为“纳米药丸”概念，能直接释放功能性重组蛋白，生产成本显著低于其他蛋白药物。无内毒素的IBs在功能性和安全性上具有优势，但进入市场需克服各国监管挑战，包括验证有效性、安全性和批次一致性。

**3.7. Heterogeneity of Available Evidence**
现有证据存在显著异质性：动物模型差异（鱼类与哺乳动物，如牛与猪对相同IB配方反应不同）、给药途径多样（口服、腹腔、肌肉等）、评估指标不一致（生存率、基因表达、抗体水平）。71%的研究仅呈现定性结果，缺乏量化数据。此外，表达系统（E. coli vs. L. lactis）、纯化方法和剂量方案各不相同，导致技术不一致，影响可重复性。尽管异质性限制了定量分析，但定性综合揭示了有用模式，可指导未来研究。

**4. Conclusions**
包涵体（IBs）生物材料在蛋白质类型（宿主免疫蛋白和病原体抗原蛋白）和给药途径上表现出多功能性，已在虹鳟、塞内加尔鳎、斑马鱼、牛、羊、猪和小鼠中显示出免疫调节和疾病控制效果。它们无毒性，能被细胞高效摄取，增强巨噬细胞介导的先天免疫。然而，仍需优化生产工艺以确保一致性和可扩展性、降低成本，并在更广泛物种和病原体中验证效力。深入研究其免疫调节机制并与其它治疗策略结合，有望革新畜牧业和水产养殖的疾病管理，推动更可持续和高效的实践。