一种检测荷兰死亡黑鸫组织中USUV NS1特异性抗体的侧流微阵列免疫分析

《Virus Research》：A lateral flow microarray immunoassay to detect USUV NS1-specific antibodies in tissues of deceased blackbirds in the Netherlands

　　

虫媒病毒是通过节肢动物（如蜱和蚊）传播的病毒，由于其地理分布和发病率持续增加，被认为是新兴病原体。乌苏图病毒（Usutu virus, USUV）是黄病毒科（Flaviviridae）的一种虫媒病毒，已在鸟类作为扩增宿主、库蚊（Culex）作为媒介的动物流行循环中被证实。通过蚊虫叮咬，USUV可偶尔溢出感染马和人，这些宿主为终末宿主（Nikolay, 2015）。USUV于2016年在荷兰首次检测到，主要见于欧亚黑鸫（Turdus merula），随后在荷兰献血者中也被检出（Rijks et al., 2016; Zaaijer et al., 2019）。与多个鸟类物种中反复出现的季节性传播一致，截至2018年报告了鸟类重大疫情，并于2022年再次出现循环。欧亚黑鸫始终与高感染率和死亡率相关，使其成为监测的关键哨兵物种（Münger et al., 2025）。此外，在荷兰发现的其它USUV易感鸟类物种，包括但不限于欧亚歌鸫（Turdus philomelos）、松鸦（Garrulus glandarius）、家麻雀（Passer domesticus）和蓝山雀（Cyanistes caeruleus）也有报道（Münger et al., 2025）。西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）于2020年在荷兰首次从一只白喉林莺（Curruca communis）中检出，随后在蚊虫和人中检出，血清学证据提示其持续但处于早期阶段的循环（Münger et al., 2025; Sikkema et al., 2020; Vlaskamp et al., 2020）。目前，这两种黄病毒的监测系统结合了活鸟的分子和血清学监测，以及对死亡鸟类的额外分子筛查。尽管RT-PCR等分子方法可在取样时灵敏检测死亡鸟类组织中的病毒RNA，但它们依赖于病毒物质的存在。相比之下，血清学方法检测宿主抗体，这些抗体可在病毒清除后持续存在，从而延长诊断窗口。目前，血清学监测主要使用活鸟的血清或血浆样本，而死亡鸟类通常仅通过分子方法评估。因此，尸体中的既往感染可能未被发现。将血清学检测扩展到死后样本，可以补充现有的监测方法，特别是在荷兰发生大规模死亡事件时，通过非目标（被动）监测网络可获得大量尸体（Rijks et al., 2016）。此外，通过非目标（被动）监测网络收集的尸体无需事先获得伦理批准和行政程序（Streng et al., 2023）。然而，将血清学应用于死亡鸟类存在实际挑战。酶联免疫吸附试验（ELISA）和中和试验（NT）等标准检测通常需要血清或血浆，而由于血液凝固，尸体难以获得这些样本（Campbell and Dein, 1984）。尽管已有报道在组织来源样本中检测黄病毒特异性抗体（Meister et al., 2008），但此类方法的可行性和性能仍未被充分探索。因此，在考虑将其用于现场监测之前，探究死后组织中能否可靠检测抗体是必要的第一步。侧流免疫分析（LFA）是一种成熟、几乎无需设备的方法，可快速、现场分析给定样本。为实现多分析物检测，LFA中的测试线被替换为由小型测试点组成的微阵列（van Amerongen and Koets, 2025）（补充图S1）。在先前研究中，研究人员开发了一种物种独立的WNV和USUV非结构蛋白1（NS1）侧流微阵列免疫分析（LMIA），并证明其能够检测和区分人、马、黑鸫和寒鸦血清中的WNV NS1或USUV NS1抗体（Godarzi et al., 2024）。在本研究中，研究人员评估了先前开发的LMIA能否检测野外收集的死亡黑鸫死后样本中的USUV NS1特异性抗体。作为概念验证，研究人员检测了血凝块和组织提取物（肺和肝），以评估在这些基质中检测抗体的可行性。LMIA性能以NS1蛋白微阵列（PMA）和90%空斑减少中和试验（FRNT₉₀）为参考方法进行基准比较，以初步了解不同血清学平台间的检测性能。尽管当前工作流程为实验室基础，但证明死后组织中抗体可检测性，是朝着可能开发简化的、适用于现场采样的检测策略迈出的关键第一步。此类方法可通过更广泛地利用尸体来源样本进行血清学分析，补充现有监测系统。

**论文解读：基于侧流微阵列免疫分析检测死亡黑鸫组织中USUV NS1特异性抗体**

**研究背景与问题**
乌苏图病毒（Usutu virus, USUV）是一种由库蚊传播的黄病毒，以鸟类为扩增宿主，可偶然感染马和人。自2016年在荷兰首次检测以来，USUV在欧亚黑鸫（*Turdus merula*）中持续循环，导致季节性疫情。当前监测体系结合了活鸟的分子（RT-PCR）和血清学检测，以及死亡鸟类的分子筛查。然而，分子方法依赖病毒RNA的存在，而血清学检测可识别既往感染，但通常仅用于活鸟血清或血浆样本。死亡鸟类尸体中的血清学检测面临挑战：死后血液凝固导致难以获得血清，且标准方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）和中和试验（NT）通常需要血清或血浆。此外，死后组织中的抗体检测可行性尚未充分探索。因此，开发适用于死后组织的血清学检测方法，可补充现有监测，尤其是在大规模死亡事件中，通过被动监测网络可获得大量尸体。

**研究内容与结论**
研究人员评估了前期开发的物种独立的USUV和西尼罗病毒（WNV）非结构蛋白1（NS1）侧流微阵列免疫分析（LMIA）在死亡黑鸫死后组织中的检测性能。该研究利用荷兰野生动物健康中心（DWHC）收集的2020–2022年间死亡黑鸫的肺、肝和血凝块样本，通过LMIA检测USUV NS1特异性抗体，并与蛋白微阵列（PMA）和90%空斑减少中和试验（FRNT₉₀）进行对比。结果表明，LMIA可在死后组织中检测到USUV NS1抗体，肺样本的检出率高于肝样本，且与RT-PCR结果存在部分重叠。LMIA与FRNT₉₀和PMA的一致性有限，可能反映了不同检测方法针对的抗体类型差异。该研究为利用尸体组织进行血清学监测提供了概念验证，并表明死后组织可作为可行的血清学分析基质。论文发表在《Virus Research》。

**关键技术方法**
1. **LMIA制备**：采用碳纳米颗粒（CNP）偶联USUV NS1和WNV NS1抗原，将检测偶联物固定于样品/结合垫，硝化纤维素膜上点样重复USUV NS1和WNV NS1斑点及对照斑点。
2. **样本处理与检测**：将死亡黑鸫的肺、肝和血凝块组织在冰上解冻后，用PBS孵育、旋转离心收集上清，经20倍浓缩后用于LMIA检测；LMIA结果通过肉眼定性判读和LF1定量读数仪测量斑点强度（AU）。
3. **参考方法**：采用USUV NS1和WNV NS1蛋白微阵列（PMA）检测IgY抗体，以及90%空斑减少中和试验（FRNT₉₀）检测中和抗体，比较LMIA的诊断性能。样本来自荷兰的被动监测网络。

**研究结果**
**3.1 测试的死亡黑鸫样本概况**
共纳入22只USUV RT-PCR阳性黑鸫和5只RT-PCR阴性黑鸫，分别提供9个血凝块、18个肺组织和18个肝组织提取物（阳性组）及2个血凝块、5个肺和5个肝提取物（阴性组）。阳性黑鸫主要于2022年8–9月发现于荷兰中部和南部省份。

**3.2 按RT-PCR状态和组织类型比较USUV NS1 LMIA检测结果**
在USUV RT-PCR阳性提取物中，50%（9/18）的肺、22%（4/18）的肝和38%（3/8）的血凝块呈USUV LMIA反应性。在RT-PCR阴性提取物中，仅1个肺提取物呈LMIA反应性。配对分析显示，肺样本比肝样本更易出现LMIA反应性，但差异无统计学显著性（McNemar检验，p=0.07）。

**3.3 USUV NS1特异性抗体与WNV NS1捕获抗原的交叉反应性**
在17个USUV LMIA反应性提取物中，仅USUV RT-PCR阳性肺组织亚组中，USUV NS1斑点强度显著高于WNV NS1（Wilcoxon符号秩检验，p=0.004），表明LMIA与WNV NS1的交叉反应性极小。

**3.4 USUV NS1 LMIA结果可作为分类变量处理**
定性肉眼判读与定量读数仪结果高度一致：所有定性LMIA反应性样本的斑点强度均>0，非反应性样本均为0。表明LMIA可作为分类筛查试验。

**3.5 LMIA诊断性能与FRNT₉₀和PMA的比较**
与FRNT₉₀相比，LMIA对血清阳性样本的灵敏度为46%（6/13），特异性为76%（31/41）。与USUV NS1 IgY PMA相比，LMIA灵敏度为63%（5/8），特异性为54%（6/13）。LMIA结果与FRNT₉₀或PMA无显著相关性（Fisher精确检验，p>0.05），可能因检测抗体类型不同所致。

**讨论与结论**
研究证明了NS1 LMIA可在死亡黑鸫的死后组织中检测USUV NS1特异性抗体。部分RT-PCR阳性样本未呈LMIA或FRNT₉₀阳性，可能因急性感染后未产生可检测抗体。相反，一例RT-PCR阴性样本呈LMIA阳性，提示血清学可检测病毒清除后的既往感染。肺样本检出率高于肝样本，可能源于肺组织残留血液较多、肝组织降解酶活性高或基质效应差异。LMIA与WNV NS1交叉反应性低，但仅基于USUV阳性样本，仍需更广泛评估。与FRNT₉₀和PMA的一致性有限，反映了结合抗体与中和抗体检测的差异。研究局限性包括样本量小、感染与死亡间隔未知、免疫球蛋白回收未量化等。尽管如此，LMIA作为快速、低成本筛查工具，可补充现有实验室检测，并支持进一步开发现场适用采样策略。

**结论**
本研究证明，基于NS1的LMIA可在死亡黑鸫的死后组织提取物中检测USUV NS1特异性抗体。这些发现确立了尸体来源组织作为血清学分析可行基质的地位，并为进一步发展基于尸体的监测策略奠定了基础。