酒糟源生物活性组分通过调节自噬相关PI3K/AKT信号通路抑制结直肠癌进展

《Foods》：Distillers’ Grains-Derived Bioactive Fraction Suppresses Colorectal Cancer Progression Through Modulation of Autophagy-Associated PI3K/AKT Signaling

　　

汾酒酒糟是汾酒生产过程中的主要副产物，含有丰富的来源于谷物原料和微生物发酵的生物活性成分。结直肠癌（CRC）仍然是一项全球性的健康挑战，迫切需要开发安全有效的治疗药物。研究人员成功获得了DGAE-1（distillers’ grains ethanol extract fraction 1），这是一种从汾酒酒糟中提取的具有抗结直肠癌活性的乙醇提取生物活性组分。基于MS/MS碎裂模式和数据库相似性匹配，LC-MS分析初步注释了DGAE-1组分的化学成分，主要注释化合物属于羧酸及其衍生物、有机氮化合物、有机磷酸衍生物以及其他化学类别。尽管具体的活性成分仍有待进一步阐明，但这些注释化合物可能贡献了DGAE-1组分的生物活性。DGAE-1组分抑制了结直肠癌细胞的增殖并诱导了自噬。进一步研究表明，PI₃K/AKT通路参与了DGAE-1组分诱导的自噬。研究结果表明，DGAE-1组分在细胞和动物模型中均发挥了抗结直肠癌活性。这些发现为汾酒酒糟的开发利用提供了新的见解，并突显了其作为健康相关应用中生物活性化合物来源的潜力。

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。尽管在结直肠癌的治疗上已取得显著进展，但耐药性、不良反应及肿瘤复发等仍是临床面临的重大挑战。近年来，越来越多的天然源生物活性化合物被报道可通过调节自噬来抑制肿瘤生长。自噬是一种高度保守的细胞内降解和循环过程，在肿瘤发展中发挥着复杂的双重作用；过度激活的自噬能够促进肿瘤细胞死亡，从而发挥抗肿瘤效应，因此诱导细胞毒性自噬已成为癌症治疗的一种有前景的策略。汾酒作为中国传统的清香型白酒，其在地缸中进行的固态发酵形成了独特的微生物群落结构，使汾酒酒糟中不仅保留了丰富的谷物源营养物质，还积累了微生物代谢产生的多种生物活性物质。然而，目前汾酒酒糟大多数仅被用作动物饲料或肥料，其高价值利用严重不足；且此前的粗提物研究存在化学成分不明、分析方法未充分公开等问题。为了建立可靠的化学图谱以进行生物学评估，并探索酒糟是否通过调节自噬抑制结直肠癌进展，研究人员开展了这项研究，发表在《Foods》期刊上。该研究得到了具有抗结直肠癌活性的组分DGAE-1，揭示了其通过调节PI₃K/AKT信号通路诱导自噬的分子机制，为汾酒酒糟的高值化利用及天然抗结直肠癌药物的开发提供了重要依据和新的见解。

在关键技术方法方面，研究人员采用了大孔吸附树脂结合梯度洗脱对汾酒酒糟的乙醇粗提物进行分离纯化以获得活性组分，并利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对其化学成分进行初步鉴定。体外实验选用了人正常结肠上皮细胞系FHC以及人结直肠腺癌细胞系SW620和HT-29进行细胞培养，通过MTT比色法、克隆形成实验和流式细胞术评估细胞活力与凋亡，并运用mCherry-LC3_B质粒转染和吖啶橙（AO）染色观察自噬现象。此外，通过蛋白质印迹法检测自噬及PI₃K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化。在动物实验中，研究人员建立了BALB/C裸鼠皮下异种移植瘤模型，通过测量肿瘤体积和重量评估体内抗肿瘤效果，并运用组织学与免疫组织化学染色分析肿瘤及主要脏器的病理变化及相关蛋白表达。

DGAE表现出显著的抗结直肠癌活性
研究人员对汾酒酒糟进行乙醇超声辅助提取得到DGAE，并通过MTT法和克隆形成实验评估其活性。结果表明，DGAE以剂量依赖的方式显著抑制HT-29和SW620结肠癌细胞的增殖，对两种细胞的IC₅₀值分别为32.820 μg/mL和48.795 μg/mL。流式细胞术分析发现DGAE处理显著增加了细胞凋亡率，且蛋白质印迹分析显示随着DGAE浓度的增加，cleaved caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达水平显著上升，表明DGAE通过激活caspase依赖的凋亡途径抑制癌细胞增殖。

DGAE-1被鉴定为源自DGAE的活性组分
为确定具体的活性部位，研究人员利用不同极性的AB-8和SP207大孔吸附树脂对DGAE进行梯度洗脱分离。结果显示，经SP207树脂处理后的流穿部分展现出最强的抗癌活性，对HT-29和SW620的IC₅₀值仅为2.673 μg/mL和2.968 μg/mL，且对正常FHC细胞毒性较低，此部分被命名为DGAE-1。DGAE-1同样能显著抑制癌细胞克隆形成并诱导凋亡。LC-MS分析揭示了DGAE-1复杂的化学图谱，初步注释的化合物主要包括羧酸及其衍生物、有机氮化合物等，其中相对峰面积最高的是甜菜碱和2-amino-1,3,4-octadecanetriol。

DGAE-1在结直肠癌细胞中诱导自噬
由于过度激活的自噬可促使癌细胞死亡，研究人员利用mCherry-LC3_B荧光和AO染色实验观察发现，DGAE-1处理呈剂量依赖性地增加结直肠癌细胞中的自噬相关荧光信号和酸性囊泡细胞器的积累。蛋白质印迹分析证实DGAE-1增加了LC3-I/II的水平并降低了p62的表达。当使用氯喹（CQ）抑制自噬降解时，DGAE-1引起的LC3-I/II积累和p62表达进一步增加，且部分恢复了细胞活力和克隆形成能力，同时减少了cleaved caspase蛋白的表达。这表明抑制自噬会减弱DGAE-1的细胞毒性，自噬激活对其抗结直肠癌效果具有重要贡献。

DGAE-1通过PI₃K/AKT信号通路调节结直肠癌细胞的自噬
鉴于PI₃K/AKT/mTOR通路在自噬中的重要调节作用，研究发现DGAE-1处理显著降低了PI₃K、AKT和mTOR的磷酸化水平。当使用PI₃K激动剂740Y-P进行共处理时，部分逆转了DGAE-1对细胞活力和克隆形成的抑制效应，并减少了cleaved caspase的表达。此外，740Y-P降低了DGAE-1引起的AO荧光强度增加，恢复了PI₃K/AKT/mTOR的磷酸化水平及ULK1在Ser757位点的磷酸化，并逆转了LC3-I/II、Beclin-1、ATG5和p62的自噬相关蛋白变化，证明了PI₃K/AKT/mTOR/ULK1信号轴参与了DGAE-1诱导的自噬调节。

DGAE-1抑制裸鼠结直肠癌异种移植瘤的生长
为评估体内抗肿瘤活性，研究人员建立了HT-29细胞的裸鼠异种移植模型，并设立5-FU为阳性对照组。结果显示，口服DGAE-1显著抑制了裸鼠体内肿瘤的生长，减小了肿瘤体积和重量，且期间小鼠体重无明显变化。主要器官的H&E染色未观察到明显的病理损伤，肿瘤组织切片显示处理组细胞排列较对照组疏松，表明DGAE-1在体内具有可靠的抑癌作用且无明显毒副作用。

DGAE-1在体内通过PI₃K/AKT信号通路调节自噬
研究人员通过对体内异种移植瘤组织进行蛋白质印迹和免疫组化分析发现，DGAE-1处理组肿瘤组织中p62、p-AKT和p-PI₃K水平显著降低，而LC3_B-II水平升高。免疫组织化学染色结果呈现了相同的表达趋势，直接证实了DGAE-1在体内模型中同样通过抑制PI₃K/AKT信号通路并诱导自噬发挥抗肿瘤作用。

在讨论部分，研究人员指出该研究证明了膳食加工副产物酒糟来源的生物活性组分对结直肠癌的抑制作用，拓展了对酒糟潜在抗肿瘤价值的理解。虽然诱导自噬被认为是DGAE-1的重要机制，但它是作为主要的致死机制还是辅助过程仍需通过基因敲除手段验证。研究确认了DGAE-1对PI₃K/AKT/mTOR/ULK1信号轴的依赖性调节，但该通路是否为唯一介导者尚需进一步证实。针对研究局限性，DGAE-1作为复杂的混合物，其具体发挥抗结肠癌活性的关键单一化合物尚不明确，即使丰度较低的成分也可能通过协同作用发挥药效。此外，体内给药后的药代动力学特性、生物利用度及肿瘤组织的暴露量仍有待确定。研究结论表明，源自汾酒酒糟的生物活性组分DGAE-1通过抑制PI₃K/AKT信号通路并促进自噬，从而抑制结直肠癌的进展。这提示DGAE-1具备作为结直肠癌干预潜在生物活性资源的价值。鉴于DGAE-1的化学成分仅为初步鉴定，其抗结肠癌效应及调节自噬的关键活性成分仍待明确。未来的研究需聚焦于进一步分离和鉴定其中的主要有效成分，阐明单一组分对整体活性的贡献，确证抗肿瘤效果并阐明潜在的直接作用靶点，从而更深入地理解其生物活性基础与治疗潜力。