基于DNA模板金属纳米簇与外切核酸酶III辅助的目标递环扩增技术的阪崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌同步检测荧光生物传感器

《Analytica Chimica Acta》：Fluorescent biosensor for simultaneous detection of C. sakazakii and S. typhimurium using DNA-templated metal nanoclusters and Exonuclease III-assisted target recycling amplification

　　

摘要

在食品行业中，对多种食源性病原体进行灵敏且同时的检测已变得极为重要。本研究设计了一种荧光信号型生物传感器，该传感器以DNA模板金属纳米簇作为信号纳米标签，并采用外切核酸酶III辅助的目标回收策略，用于检测坂崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。该检测系统由经羧基化处理的聚吡咯纳米颗粒构成，这些颗粒上功能化了HP1和HP2两种发夹状DNA序列；同时还包含了坂崎肠杆菌的ompA基因序列以及鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列，此外还有基于DNA模板的金纳米簇和银纳米簇纳米标签，以及外切核酸酶III。在目标物质存在时，cPPy表面的HP1和HP2序列会通过杂交作用打开，形成tDNA1-HP1-cPPy-HP2-tDNA2复合体。随后，这些被打开的HP1和HP2会分别与对应的sDNA1和sDNA2结合，从而使检测系统中的金纳米簇和银纳米簇的荧光强度上升。此外，通过EATR放大策略，目标物质可被外切核酸酶III切割并从复合体中释放出来，进而进入下一个HP1/HP2开放循环，如此一来，金纳米簇和银纳米簇的荧光信号便可显著增强。在最佳条件下，该荧光生物传感器对坂崎肠杆菌的检测范围为1.64～1.64×10⁵ CFU/mL，对鼠伤寒沙门氏菌的检测范围为2.56～2.56×10⁵ CFU/mL，其最低检测限分别为1.4 CFU/mL和2.2 CFU/mL。该生物传感器已被用于实际样品中检测坂崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，检测结果的回收率分别在88.8%至110.6%之间，以及在90.4%至114.4%之间。

引言

纳米簇是指尺寸介于原子或分子与纳米粒子之间的纳米结构[1]。这类纳米结构通常由大约10到数百个原子组成，直径在2～3纳米左右[2]。迄今为止，人们已经合成了多种类型的纳米簇，包括金属纳米簇[3]、金属氧化物纳米簇[1]以及掺杂杂原子的金属纳米簇[4]、[5]。这类纳米材料具备独特的性质[6]、[7]、[8]，比如出色的稳定性和生物相容性、低毒性，以及易于进行表面功能化处理。目前，纳米簇已被广泛应用于传感领域[9]、[10]和生物传感领域[11]、[12]，以及生物成像领域[13]、[14]，还有医疗治疗领域[5]、[15]。

具有独特光学、电子、化学和物理性质的金属纳米簇在研究领域受到了极大关注。通常，金属纳米簇可分为三类。第一类是单金属纳米簇，包括金纳米簇[AuNCs][16]、[17]、银纳米簇[AgNCs][11]、[12]、铜纳米簇[7]、[18]以及铂纳米簇[19]。第二类是双金属纳米簇[20]，例如AuAgNCs[21]、AuCu NCs[9]和CuAgNCs[22]。第三类则是掺杂杂原子的金属纳米簇[4]、[5]。在这些金属纳米簇中，基于金和银的纳米簇因其稳定的且可调控的光致发光特性而得到了广泛研究。例如，通过使用不同的稳定剂，如蛋白质[5]、[23]、肽类[13]、[24]以及DNA/适配体序列[25]、[26]、[27]，就可以调控金纳米簇和银纳米簇的荧光特性。特别值得关注的是，人们已经利用经过设计的DNA序列作为模板，将具有不同荧光特性的金纳米簇和银纳米簇制成各种生物传感器。例如，就有研究利用两种设计的发夹状DNA序列作为模板合成了具有不同荧光特性的银纳米簇，并将其用作生物传感中的信号纳米标签[26]。通过整合无酶催化发夹组装信号放大策略，人们还开发出一种灵敏且具有选择性的荧光生物传感器，可用于同时检测转基因植物中的CaMV35S和NOS，且其最低检测限较低。

对食源性病原体的检测是针对食品产品以及食品企业及其供应链相关机构（如食品包装厂）所生产的商品而言的一项必要检测要求。这些企业生产的大部分产品都必须经过经认可的第三方检测机构的安全评估，而获取检测结果往往需要超过半年的时间。因此，迫切需要开发出快速、灵敏且具有选择性的方法来检测食源性病原体，尤其是能够同时检测多种食源性病原体的方法[28]。

用于同时检测多种食源性病原体的方法包括比色法[29]、电化学法[30]、表面增强拉曼光谱法[SERS][31]、电感耦合等离子体质谱法[ICP-MS][27]以及荧光法[32]。为了提高生物传感器的灵敏度，有必要采用有效的信号放大策略，比如环介导等温扩增技术[LAMP][33]、聚合酶链反应扩增技术[PCR][34]以及重组酶聚合酶扩增技术[RPA][32]。由于金属纳米簇具备独特的性质[27]、[35]，它们已被应用于多种食源性病原体的检测中。例如，Yao等人[27]就利用ICP-MS技术，开发出一种基于金属纳米簇的信号放大生物传感器，可用于同时检测金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及鼠伤寒沙门氏菌。他们采用了三种不同的适配体作为模板，分别合成金纳米簇、银纳米簇和铜纳米簇，然后将这些纳米簇作为识别信号纳米标签，用于识别并放大检测这三种目标物质，其最低检测限为10 CFU/mL。

外切核酸酶III辅助的目标回收策略[EATR][36]已被证明是一种可用于生物传感中灵敏检测目标物质的有效方法。在本研究中，我们设计了一种荧光信号型生物传感器，用于同时检测坂崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。我们以两种不同的DNA序列作为模板（见图1A），制备了基于DNA模板的金纳米簇和银纳米簇，将其作为荧光信号纳米标签。与此同时，我们还制备了经羧基化处理的聚吡咯纳米颗粒，并通过胺化反应使其与两种设计的发夹状DNA序列结合，从而形成HP1-cPPy-HP2纳米颗粒（见图1B）。如图1C所示，HP1和HP2序列能够分别与坂崎肠杆菌的ompA基因序列以及鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列发生杂交而打开。此外，设计好的HP1和HP2序列中的某些碱基也能分别与sDNA1和sDNA2序列中的碱基发生杂交。这样一来，当ompA基因和invA基因使HP1和HP2序列打开后，sDNA1-AuNCs和sDNA2-AgNCs就会与HP1-cPPy-HP2纳米颗粒上被打开的HP1和HP2序列结合，从而在HP1-cPPy-HP2纳米颗粒表面引入信号纳米标签。这样一来，检测系统中的金纳米簇和银纳米簇的荧光强度就会上升。而且，在外切核酸酶III的协助下，ompA基因和invA基因会被从HP1-cPPy-HP2纳米颗粒中释放出来，进而进入下一个HP1/HP2序列开放循环，从而显著放大检测系统的荧光信号。

章节节选

材料与试剂

三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）、吡咯单体、1H-吡咯-3-羧酸、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、聚乙烯醇（PVA）、牛血清白蛋白（BSA）以及硫酸奎宁均购自中国上海的Aladdin Industrial Co., Ltd.。罗丹明B（RhB）、硫酸奎宁、硝酸银、硼氢化钠以及四水合四氯合金酸汞则购自中国上海的国家医药集团上海化学试剂有限公司。

所制备纳米材料的表征

展示了cPPy、sDNA1-AuNCs以及sDNA2-AgNCs的形态结构。图1A和图1B显示了所制备的cPPy的形态。从图中可以看出，cPPy纳米颗粒在200纳米（见图1A）和50纳米（见图1B）的观测尺度下分布十分均匀，其平均直径约为56.75 ± 5.65纳米。图1C则显示了所制备的sDNA1-AuNCs在10纳米的观测尺度下分布均匀，且呈现球形结构。sDNA1-AuNCs的尺寸分布

结论

总之，本研究成功开发出一种灵敏且具有高特异性的“信号激活型”荧光生物传感器，可用于同时检测坂崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。该生物传感器采用了基于DNA模板金纳米簇和银纳米簇的双重发射信号纳米标签，并结合了EATR信号放大策略。首先，sDNA1-AuNCs和sDNA2-AgNCs能够发出稳定的荧光，且能够分别与被打开的HP1和HP2序列特异性结合。这种结合反应是在目标物质被识别后的结果

CRediT作者贡献说明

叶永康：撰写——审阅与编辑、可视化处理、项目监督、项目管理、方法设计、资金筹集。 龚金英：实验研究、资金筹集。 魏兆军：撰写——审阅与编辑、项目监督、资源协调。 孙宇涵：撰写——审阅与编辑、资源协调、资金筹集。 曹晓东：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、实验研究、资金筹集、正式分析、概念构思。 刘敏利：撰写——初稿撰写

利益冲突声明

我们声明，自己与他人或任何组织之间不存在可能影响我们工作的财务或个人关系，也不存在任何可能与本文所阐述的观点或对本文的评审产生影响的、涉及任何产品、服务及公司的专业或其他个人利益。

致谢

我们衷心感谢以下机构提供的资金支持：中国国家自然科学基金（项目编号32402216）、安徽省自然科学基金（项目编号2408085QC108）、大学生创新创业训练计划（项目编号202610359138），以及企业委托项目（W2023JSKF1100和W2025JSKF0674）。本文中的部分分析工作是在合肥工业大学的仪器分析中心完成的。

Xiaodong Cao|Mingli Liu|Yifei Pan|Qiuran Wang|Jinying Gong|Yongkang Ye|Yuhan Sun|Zhaojun Wei

中国合肥230601，合肥工业大学食品与生物工程学院