超分辨STED成像揭示胞外聚合物调控下纳米颗粒在细胞内的聚集与溶解

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Super-resolution STED imaging revealed intracellular aggregation and dissolution of nanoparticles governed by extracellular polymeric substances

　　

常规光学显微镜无法直接观察纳米颗粒独特的摄取与内化过程，因此界面性质如何调控其细胞内转化仍知之甚少。研究人员将受激辐射损耗（STED）纳米显微技术与聚集诱导发光（AIE）标记的银纳米颗粒（AgNPs）相结合，在活体莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞中直接可视化单纳米颗粒的摄取。STED成像显示AgNPs主要通过鞭毛附近的顶端区域进入藻细胞，为先前假设的摄取途径提供了直接视觉证据。更重要的是，野生型（WT）细胞与缺壁（-CW）菌株表现出根本不同的细胞内转化行为。在WT细胞中，内化的AgNPs经历瞬时聚集后逐渐溶解，导致细胞内Ag+水平高出12.3%；相反，-CW细胞中AgNPs倾向于形成稳定较大的聚集体且溶解受抑。进一步分析表明，胞外聚合物（EPS）在纳米颗粒内化前调控该过程中起关键作用。源自-CW细胞的EPS表现出更高的多糖富集与更低的静电稳定性，促进细胞外AgNPs聚集及随后的细胞内滞留。细胞内溶解行为的差异进一步导致不同的氧化应激响应，WT细胞表现出比-CW细胞更强的活性氧（ROS）积累与谷胱甘肽（GSH）变化。该研究建立了连接细胞外界面调控与细胞内纳米颗粒转化及响应的机制框架。

研究背景与立项依据

纳米工程材料广泛应用使其环境风险评价面临挑战，其中银纳米颗粒（AgNPs）因强抗菌性被大量释放至淡水生态系统。莱茵衣藻作为代表性淡水绿藻模型，对AgNPs敏感，其毒性与纳米颗粒摄取、聚集、溶解及Ag⁺释放等细胞内转化过程密切相关。已有研究多关注细胞内生理过程导致的异质性，而细胞外界面（尤其是胞外聚合物EPS）在纳米颗粒进入细胞前的调控作用缺乏直接可视化证据。常规光学显微镜受衍射极限限制无法分辨纳米级聚集态，电子显微镜难以实现活体实时成像。因此，研究人员开展本研究，旨在建立从细胞外界面到细胞内转化的机制联系，直接可视化活体微藻中单颗粒动态。

主要技术方法概括

研究人员以野生型（WT）与缺壁（cw15，-CW）莱茵衣藻为模型系统，构建AgNPs@AIE探针（AIEgen标记银核壳结构）。采用受激辐射损耗（STED）纳米显微镜（488 nm激发/775 nm损耗）结合时间门控策略（延迟4 ns抑制叶绿素自荧光）实现活体细胞单颗粒追踪；以纳米颗粒示踪分析（NTA）与zeta电位表征EPS介导的胞外聚集；共聚焦显微镜联合Ag⁺特异性探针TEZ-TPE-1区分AgNPs与溶解Ag⁺；流式细胞术检测ROS（H₂DCFDA）与GSH（monochlorobimane）；ICP-MS定量细胞内Ag累积。样本队列为实验室培养WT与中科院水生所提供cw15菌株。

研究结果

3.1 AgNPs@AIE表征：STEM确认球形核壳结构（Ag核约46.77 nm半径，AIE壳层），DLS水动力学直径384.3 nm，荧光激发480.86 nm/发射578.97 nm（斯托克斯位移98.11 nm），适合STED长时成像。

3.2 活体STED平台建立：损耗激光约15%最大功率下横向分辨率由250.66 nm提升至128.61 nm；时间门控4 ns几乎消除叶绿素自荧光而保留AIE信号，实现特异可视化。

3.3 顶端进入途径直接可视化：ICP-MS定量确定0.5 μg/mL为无细胞毒性的适宜成像浓度；STED直接显示AgNPs先吸附EPS层，再向鞭毛附近顶端区迁移内化，为既往假设途径提供首例直接影像证据。

3.4 细胞壁完整性决定细胞内聚集差异：WT细胞4 h出现瞬时聚集（平均聚集体强度19.52 a.u.，核富集），12 h聚集体减弱分散（聚集体比例33.0%降至18.2%），伴AgNPs荧光略升；-CW细胞4 h聚集弱，12 h持续生长为大聚集体（平均62.07 a.u.，比例达81.7%）并稳定滞留核区。

3.5 EPS性质调控内化前聚集：NTA显示-CW EPS体系中AgNPs平均粒径增至396 nm且现~1000 nm峰，WT EPS体系为335 nm；-CW EPS多糖富集更高、蛋白/多糖比更低、zeta电位绝对值下降更显著（12 h为-16.4 mV vs WT -34.4 mV），静电排斥减弱促聚集。Pearson相关显示胞内聚集比与胞外粒径正相关（r=0.77）。

3.6 聚集态决定Ag⁺释放与氧化还原分化：共聚焦显示WT细胞12 h Ag⁺信号1135 a.u.高于-CW的996.2 a.u.，而-CW的AgNPs信号3270 a.u.高于WT的2584 a.u.；流式显示WT经12 h暴露ROS升至对照154.1%、GH耗至33.6%，-CW分别为126.4%与78.9%。聚集大颗粒比表面积小、溶解慢，故-CW氧化应激弱。

讨论与结论翻译

生物界面异质性在很大程度上调控纳米颗粒在水生系统中的环境影响与生态风险。天然浮游植物在细胞壁、EPS产量及化学成分上差异广泛，塑造了不同的细胞外微环境。依赖暴露浓度与传统理化指标的常规生态风险评估通常忽视这一关键生物异质性。本研究在微藻中将EPS细胞外界面性质、细胞内纳米颗粒转化及生理后果相联系。通过STED纳米镜克服衍射极限，研究人员实现了活体莱茵衣藻中单纳米颗粒行为（包括顶端进入途径与菌株特异性聚集过程）的可视化。结果强调细胞壁完整性重塑EPS组成与静电微环境，从而在细胞内化前调控AgNPs的胞外聚集态，并最终决定其细胞内分布模式与Ag⁺释放效率。氧化还原响应进一步证实EPS调控的纳米颗粒行为强烈影响AgNPs的生态毒性。尽管对生物界面作用提供了新见解，仍需明确具体分子相互作用与详细细胞内转化路径，未来结合先进光谱与分子方法有价值。总体而言，研究显示包含细胞壁与EPS组成的细胞外界面调控AgNPs过程，为微藻中价态转化与溶解提供了直接视觉与机制证据，表明纳米颗粒归趋与毒性不能仅由常规整体测量理解，自然水体纳米行为风险评估须考虑生物界面。论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。