《Cell Reports》：Reprogramming lineage-traced Müller glia for robust proliferation and neurogenesis in adult mammalian retinas
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腺相关病毒（AAV）介导的一步法胶质细胞向神经元转化（G2N转换）的治疗潜力在经过严格的谱系示踪分析后受到质疑。在斑马鱼中，Müller胶质细胞（MG）作为视网膜干细胞，在损伤后补充丢失的神经元。相比之下，哺乳动物MG不会自发重新进入细胞周期，且对神经毒性损伤
腺相关病毒（AAV）介导的一步法胶质细胞向神经元转化（G2N转换）的治疗潜力在经过严格的谱系示踪分析后受到质疑。在斑马鱼中，Müller胶质细胞（MG）作为视网膜干细胞，在损伤后补充丢失的神经元。相比之下，哺乳动物MG不会自发重新进入细胞周期，且对神经毒性损伤的反应仅发生有限的神经发生。在此，研究人员证明了在AAV介导的Ascl1（Achaete-scute homolog 1）基因转移后，FGF2/MAPK信号的激活可有效刺激成年小鼠中谱系示踪的MG发生稳健的细胞周期重入，且不依赖于神经毒性损伤。通过添加视黄酸（RA），该方法进一步将大量增殖的MG来源祖细胞样细胞重编程为再生状态，从而驱动体内神经发生的增强。利用多重分析技术，研究人员揭示了体内MG来源神经发生过程中细胞命运转变的不同阶段。该方法提供了一个诱导MG增殖及随后的MG来源神经发生的两步策略，可能代表了视网膜再生的一条有效途径。
成年的哺乳动物中枢神经系统（CNS）在神经退行性疾病或创伤性损伤后缺乏再生能力，常导致永久性功能丧失。通过唤醒机体内在的再生能力，将驻留的胶质细胞重编程为神经元以补充丢失的神经元，具有巨大的治疗潜力。然而，严格的谱系示踪技术揭示，此前基于腺相关病毒（AAV）介导的重组因子基因转移所报告的胶质细胞直接转化为神经元的现象，往往源于对原有神经元的错误标记，而非真正的胶质细胞来源。此外，AAV诱导的细胞毒性甚至能够消除成年小鼠海马体中的神经发生，这引发了对其在体内神经再生研究中应用的担忧。视网膜作为CNS的一部分，其解剖结构和功能特点使其成为研究再生的便利模型。视网膜神经元的丢失是视力障碍和失明的根本原因。在冷血脊椎动物如斑马鱼中，视网膜损伤后Müller胶质细胞（MG）能作为内源性视网膜干细胞/祖细胞，经历不对称分裂产生MG来源多能祖细胞（MGPC），经过多轮细胞分裂后分化为新的视网膜神经元。而在哺乳动物中，MG在损伤后主要发生反应性胶质增生而非重新进入细胞周期。常用的NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸）诱导的兴奋性毒性损伤不仅再生效果有限，还会大量杀死视网膜神经元。以往通过过表达细胞周期蛋白D1、激活Wnt信号或抑制Hippo途径尝试激活MG增殖，但仅能使极小部分MG进行一轮分裂。因此，亟需一种不依赖于大规模杀伤神经元的损伤、能刺激MG进行多轮分裂、并促使其进入再生状态进而神经发生的全新策略。
为此，研究人员开展了一项旨在实现成年小鼠视网膜MG增殖与神经发生的研究，并证明了通过AAV基因转移促神经bHLH转录因子Ascl1并结合成纤维细胞生长因子2（FGF2）与视黄酸（RA）的FAR重编程范式，能够克服上述多重障碍，其研究成果发表在《Cell Reports》。为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先构建了基于他莫昔芬诱导的Glast-CreERT与Rosa-CAG-LSL-Sun1-GFP或tdTomato报告基因小鼠交配的严格谱系示踪小鼠模型；利用ShH10伴侣GFAP微小启动子的AAV载体实现目的基因在MG中的特异性递送；通过EdU/BrdU双标记技术结合免疫组织化学验证细胞增殖和神经元标志物表达；并通过流式细胞分选（FACS）纯化目标细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），利用拟时序分析解析细胞命运轨迹。
研究结果部分总结如下：
AAV介导的基因递送在体内重编程谱系示踪的MG
通过对他莫昔芬诱导的谱系示踪小鼠进行检测，证实了Sun1-GFP和tdTomato标记对MG的标记具有极高的特异性和效率。利用ShH10-GFAP微小启动子构建的AAV载体能够高效且特异性地在成年小鼠MG中表达目的基因如Ascl1，为后续的体内重编程研究奠定了基础。
FGF2与Ascl1结合在无损伤条件下激活MG的稳健增殖
在AAV介导Ascl1基因转移后，通过玻璃体注射FGF2（即FA处理），在不需要NMDA诱导的兴奋性毒性损伤的情况下，能刺激大量谱系示踪的MG重新进入细胞周期。通过EdU掺入以及Ki67和PH3等细胞周期标志物的共染色证实了MG的活跃增殖。
FA刺激MG进行连续多轮分裂
利用EdU/BrdU双标记技术，研究表明FA处理不仅促使MG重新进入细胞周期，还能使部分细胞经历连续多轮的细胞分裂，如同单个视网膜祖细胞经过多轮分裂产生多个子代细胞的克隆扩增现象。
FGF2激活MG中的MAPK/Erk和PI3K/Akt信号通路
研究发现FGF2在MG中强烈激活MAPK/Erk信号通路，并轻度激活PI3K/Akt信号通路，且这些激活独立于Ascl1的基因转移，证明FGF2具有直接调控这些下游关键信号级联的能力。
MAPK/Erk和PI3K/Akt信号通路调节成年小鼠MG增殖
通过药理学抑制及功能获得性分析证实，MAPK/Erk信号在介导FGF2对MG的促有丝分裂作用中起主导地位，而PI3K/Akt信号起协同和辅助作用。共激活这两条通路能产生更显著的MG增殖反应，且该过程不依赖于Hippo-YAP信号通路。
FAR处理重编程MG进入再生状态以用于后续神经发生
在FA处理基础上添加RA形成FAR处理范式，发现该处理能促使MG表达光感受器/双极细胞标记物Otx2和Crx，并逐步丢失原有MG标志物Sox9，呈现神经元形态。RA的加入增强了MG向光感受器和双极细胞的神经发生而不影响细胞增殖，且该过程不引起显著的细胞凋亡。而NMDA诱导的神经毒性损伤则会抑制FAR诱导的MG增殖，并将神经发生偏向于视网膜内部神经元命运。
单细胞转录组测序揭示FAR处理后MG向神经元重编程过程中的细胞状态多样性
通过scRNA-seq分析，研究人员揭示了从静息态MG向增殖态MG、MGPC、反应性MG，最终向神经源性中间态、视杆样、双极细胞样等多个细胞簇的动态演变。证实了RA信号靶基因Btg2的逐渐上调提领了从增殖状态向神经元分化状态的转变。
轨迹分析表明FAR处理后的MG向视网膜神经元命运分化而非恢复至静止状态
拟时序轨迹分析强烈表明，细胞周期重入的MG在退出细胞周期后并未恢复至静息状态，而是依次经历了细胞周期与分裂、向祖细胞样状态及神经源性状态的过渡，最终分化为参与视觉功能的特定视网膜神经元命运。
小胶质细胞在FAR处理后促进MG增殖但抑制神经再生
研究表明，小胶质细胞的激活与炎症反应在FAR处理早期促进了MG的增殖，但利用PLX3397清除小胶质细胞后，尽管MG增殖适度减弱，却显著增强了MG来源的神经发生向光感受器及无长突细胞的分化，表明小胶质细胞在MG增殖与神经分化阶段具有双重且相反的调控作用。
在讨论与结论部分，研究人员总结道，本研究展示了严格的谱系示踪MG可以通过AAV介导的基因递送与特定外源因子的结合被逐步重编程为祖细胞和未成熟视网膜神经元。与以往依赖NMDA损伤且多为直接转分化不同，FAR重编程范式依赖于FGF2及其下游关键的MAPK/Erk信号通路，在无神经元杀伤性损伤的条件下成功解锁了MG的稳健增殖和多轮分裂。利用RA的辅助，重编程后的MG进入了类似斑马鱼自然发生的再生状态，最终分化为视杆细胞、双极细胞及无长突细胞样神经元。研究还强调了微环境中的小胶质细胞在调控重编程进程中的重要作用。总体而言，该研究提供了一种有效的两步重编程策略和全新的生物学见解，不仅证明了使用严密谱系示踪可以真实实现AAV介导的体内胶质向神经元转化，也为在成年哺乳动物视网膜中实现内源性高效神经再生与视力恢复开辟了一个极具潜力的新途径。
