OTOF基因变异所致听觉神经病变中国患者的听觉表型、自然病程及干预

《Ear and Hearing》：Audiological Phenotype, Natural History, and Intervention in Chinese Patients With Auditory Neuropathy Caused by OTOF Variants

　　

**目标：** 探索 OTOF 基因变异所致听觉神经病 (AN) 患者基因型与表型、疾病进展及干预结局之间的相关性。

**设计：** 通过全外显子测序或基因 panel 测序识别与 OTOF 变异相关的 AN 患者。根据美国医学遗传学与基因组学协会 (ACMG) 指南解读变异。进行听力学测试，包括听觉脑于反应 (ABR)、畸变产物耳声发射 (DPOAE)、行为测听/纯音测听等。分析患者的遗传学和听力学特征。随访患者的疾病进展和干预情况，结合基因型分析表型差异。

**结果：** 共识别出 43 例 OTOF 基因变异 AN 患者，包括 7 个新变异。纯音平均听阈为 89.20 ± 17.81 dB HL，91.11% 的患者为重度听力损失或以上。随着病程增加，听觉稳态反应和 DPOAE 结果恶化。25 例患者接受了人工耳蜗植入，听觉表现分级 (CAP) 得分为 7.00 (5.00, 7.50)。双等位基因功能丧失变异的患者听力较差的趋势明显，但 DPOAE 反应率较高。同样，单个等位基因导致蛋白截断变异的患者 DPOAE 检出率也较高。

**结论：** 鉴定了 OTOF 基因的 7 个新突变，丰富了 OTOF 基因变异谱。大多数 OTOF 变异的 AN 患者表现为重度至极重度听力损失，且随病程进展而加重。人工耳蜗植入效果良好，与干预年龄和时长有关。OTOF 变异的基因型与表型之间存在相关性趋势。

**引言**
听觉神经病 (AN) 是由于内毛细胞 (IHC)、突触、螺旋神经节细胞和/或听神经本身功能障碍引起的听觉信息处理障碍（Starr 等，1996；Rance & Starr，2015；中国多中心临床研究协作组等，2022），可发生在生命周期的各个阶段，尤其是婴儿和青少年期。不同人群中，AN 占听力损失病例的 1.2% 至 8.4%（Foerst 等，2006；Penido & Isaac，2013；Vignesh 等，2016），在低风险新生儿人群中占 0.006% 至 0.039%（Korver 等，2012）。遗传因素和环境风险因素均被认为与 AN 有关。已有十余个基因被发现与 AN 相关（Shearer & Hansen，2019；H. Wang 等，2024b），其中 OTOF 是第一个被确定为与常染色体隐性非综合征型 AN 相关的基因。OTOF 基因编码的蛋白耳铁蛋白 (Otoferlin) 主要集中在耳蜗 IHC 的基底外侧部分，是 IHC 突触前结构的重要组成部分。Otoferlin 作为一种钙传感器，触发 IHC 带状突触处的膜融合，从而在突触囊泡的外排中发挥关键作用。不同 AN 人群中都报道过 OTOF 基因变异，但各研究中的携带频率不同（Varga 等，2006；Rodriguez-Ballesteros 等，2008；Romanos 等，2009；Matsunaga 等，2012；Iwasa 等，2013；Zhang 等，2016a）。针对 OTOF 变异的 AN 患者，基础和临床基因治疗已成功实施（Lv 等，2024；Qi 等，2024a, b, 2025；H. Wang 等，2024a）。这些研究中的首要关键步骤是确认 OTOF 变异的致病性。

我们此前的研究表明，OTOF 基因变异是婴儿 AN 最常见的遗传病因（Zhang 等，2016a）。在本研究中，共招募了 43 例具有 OTOF 纯合或复合杂合变异的 AN 患者，并分析了基因型与表型的相关性，为临床管理和遗传咨询提供证据。

**材料与方法**

**研究参与者（病例招募与临床评估）**
共招募了 43 例具有 OTOF 纯合或复合杂合变异的 AN 患者。听力学评估包括纯音测听/行为测听、听觉脑干反应 (ABR)、畸变产物耳声发射 (DPOAE)、听觉稳态反应 (ASSR) 和电耳蜗图 (ECochG)（补充数字内容 1，https://links.lww.com/EANDH/B851）。纯音平均听阈 (PTA) 定义为 500、1000、2000 和 4000 Hz 频率的平均阈值（Thorpe 等，2021）。根据 PTA，听力损失严重程度定义为轻度 (20 至 35 dB HL)、中度 (35 至 50 dB HL)、中重度 (50 至 65 dB HL)、重度 (65 至 80 dB HL)、极重度 (80 至 95 dB HL) 或全聋 (≥95 dB HL)。使用插入式耳机并采用反向极性且阻塞刺激导管以减少电伪影来记录耳蜗微音器 (CM)。基于纯音测听/行为测听技术，在声场中测试助听听阈，受试者佩戴助听设备。部分病例进行了高分辨率计算机断层扫描和/或磁共振成像，以评估中耳和内耳的结构异常。根据独立设计的问卷（Song 等，2021）进行电话随访，收集患者病情变化、干预、语言发育、成长、教育以及前庭功能情况，包括：眩晕视觉模拟量表 (VAS)、头晕障碍量表 (DHI) 和眩晕症状量表 - 中文版 (VSS-C)。

纳入标准：经 (1) 存在耳声发射 (OAE) 和/或 CM；(2) ABR 异常或缺失（Gravel 等，2004；Hayes 等，2008；Dworsack-Dodge 等，2012；Feirn 等，2013；Constantina Georga 等，2019；中国多中心临床研究协作组等，2022）；(3) 根据美国医学遗传学与基因组学协会 (ACMG) 指南（Richards 等，2015；Oza 等，2018）遗传检测阳性诊断的 AN 病例。
排除标准：(1) 听神经瘤；(2) 病例或其监护人拒绝进行遗传检测；(3) 仅识别出一个 OTOF 变异的病例。对于有家族史的病例，本研究仅招募先证者，家庭成员仅用于分离分析，而非表型分析。

**研究监管**
本研究经中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准（编号：S2020-228-01）。所有参与者或其监护人均签署了书面知情同意书。

**基因检测**
采集外周血样本，加入 EDTA 抗凝，随后将样本储存于 -80°C。使用 MagPure Buffy Coat DNA Midi KF Kit 全血 DNA 提取试剂盒从外周血样本中提取 DNA。

**外显子捕获测序与变异检测**
对提取的 DNA 样本进行靶向区域捕获和测序。目标区域平均有效测序深度≥100X，且目标区域平均深度>20X 的位点比例>95%。评估原始测序reads 的质量，以去除低质量 reads 和接头 reads。使用 HG19 参考序列进行序列比对，并评估序列捕获的效果。查询单核苷酸多态性 (SNV) 和小插入/缺失 (Indel)，以生成目标区域的碱基多态性结果。变异致病性分类基于 ACMG 和分子病理学家协会序列变异解读指南（Richards 等，2015；Oza 等，2018），并参考 ClinGen 序列变异解读工作组和临床基因组学科学协会对指南进行详细解读。对于候选变异，进行聚合酶链反应 (PCR) 扩增和 Sanger 测序，以验证高通量测序结果。

**变异分类**
为了研究基因型与表型之间的相关性，将变异分为功能丧失 (LoF) 变异和非 LoF 变异。LoF 变异包括无义变异、移码变异、框内插入或缺失以及剪接变异；非 LoF 变异主要指错义变异和同义变异。根据变异是否为功能丧失突变的组合，将患者分为：双等位基因均为 LoF 变异的 LL 组、一个错义和一个 LoF 变异的 ML 组，以及双等位基因均为错义变异的 MM 组。

根据变异是否导致蛋白截断对变异进行分类。导致蛋白截断的变异包括无义突变和移码突变。未导致蛋白截断的变异包括框内插入或缺失、剪接变异、错义突变和沉默突变。根据变异是否导致蛋白截断，将患者分为：双等位基因均导致蛋白截断的 TT 组、一个变异导致蛋白截断的 TN 组，以及双等位基因均无变异导致蛋白截断的 NNt 组。

根据变异是否影响 C2 结构域对变异进行分类。主要影响 C2 结构域的变异，主要指变异位点位于 C2 结构域上，或截断范围包含了 C2 结构域。不影响 C2 结构域的变异，主要指既未位于 C2 结构域上，也未导致 C2 结构域截断。根据变异是否影响 C2 结构域，将患者分为：双等位基因均影响 C2 结构域的 CC 组、一个变异影响 C2 结构域的 CN 组，以及双等位基因均无变异影响 C2 结构域的 NNc 组。

**统计分析**
使用 SPSS 20.0 和 GraphPad Prism 7 进行统计分析。正态分布的连续变量以均值±标准差表示，非正态分布变量以中位数和四分位间距表示。分类变量以计数和百分比描述。使用配对样本 t 检验分析相关正态分布连续变量的差异，使用非参数 Wilcoxon 检验分析相关异常分布连续变量和有序分类变量的差异，使用 McNemar 检验分析配对样本无序分类变量的差异。使用 Spearman 秩相关分析测试异常分布样本的相关性。使用独立样本 t 检验分析独立样本正态分布连续变量的差异，使用非参数 Kruskal-Wallis 检验分析独立样本异常分布连续变量和有序分类变量的差异，使用卡方检验分析独立样本无序分类变量的差异。使用方差分析分析组间正态分布连续变量的差异。P<0.05 被认为具有统计学意义。

**结果**
本研究共招募了 43 例 OTOF 变异 AN 患者，包括 23 例男性 (23/43, 53.49%) 和 20 例女性 (20/43, 46.51%)。在 43 例患者中，3 例缺失民族数据，1 例为满族，其余 39 例为汉族。测试年龄范围为 0.33 至 28 (3.35 ± 5.45) 岁，发病年龄范围为 0 至 3 (1.02 ± 0.75) 岁。4 例 (4/43, 9.30%) 被诊断为温度敏感性听觉神经病。获得 16 例患者 (16/43, 37.21%) 的普遍新生儿听力筛查结果，OAE 通过率为 100% (16/16)，自动听觉脑干反应通过率为 0% (0/3)。未报告提示前庭功能障碍的症状（如眩晕、平衡失调）。

**OTOF 变异 AN 患者的基因型**
在 43 例患者中总共识别出 60 个 OTOF 基因变异（图 1A，补充数字内容 S1 表，https://links.lww.com/EANDH/B852，补充数字内容 S1 图，https://links.lww.com/EANDH/B853），其中 96.67% (58/60) 为致病或可能致病变异，3.33% (2/60) 为意义不明变异。识别出的变异包括 12 (12/60, 20.00%) 个移码变异、10 (10/60, 16.67%) 个无义变异、27 (27/60, 45.00%) 个错义变异、7 (7/60, 11.67%) 个剪接变异、3 (3/60, 5.00%) 个框内插入或缺失变异，以及 1 (1/60, 1.67%) 个同义变异。37 (37/60, 61.67%) 个变异位点影响了 C2 结构域，包括 19 个位于 C2 结构域上的位点和 18 个导致 C2 结构域截断的位点，而 23 (23/60, 38.33%) 个未位于 C2 结构域上。等位基因总发生频率为 88 次，41 个变异 (41/60, 68.33%) 仅检测到一次，19 个变异 (19/60, 31.67%) 检测到两次或更多次（图 1B），检测频率最高的位点是 c.5000C>A (p.Ala1667Asp)。

本研究中首次报告了7种新型变异（7/60，11.67%），其中3种为致病性变异，4种为可能致病性变异（表S2见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B852）。

打开多媒体模式 图1. 打开多媒体模式 基因检测结果。A，OTOF基因包含48个外显子，编码并翻译含1997个氨基酸的otoferlin蛋白。Otoferlin蛋白包含六个C2结构域。在本研究的43例患者中，共鉴定出60种OTOF基因变异。变异根据NM_001287489.2注释，编码NP_001274418.1。B，OTOF基因突变位点的组成比例。TSAN表示温度敏感性听觉神经病；VUS表示意义未明的变异。

根据ACMG变异指南的致病性分析，OTOF基因变异是43例患者的病因（表S3见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B852）。在43例患者中，3例（3/43，6.98%）患者有家族史，家族中有超过两名患者，40例（40/43，93.02%）患者为散发病例。5例（5/43，11.63%）为纯合变异，38例（38/43，88.37%）为复合杂合变异。

**听力学特征**

所有43例携带OTOF变异的患者（100%）双耳ABR测试均缺失或严重异常。其中，42例（97.7%）患者在最大声输出时无反应，而1例（2.3%）患者有严重异常反应，仅在100 dB nHL时记录到V波；潜伏期延长（左耳：7.95毫秒，右耳：8.05毫秒），阈值升高（左耳：95 dB nHL，右耳：90 dB nHL）。31例患者（100%）双耳可记录到CM波（图S2A见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。

43例患者（86耳）DPOAE的平均捕获率为68.15%（0至100.00%），59耳（59/86，68.60%）的捕获率大于62.5%（5/8），27耳（27/86，31.40%）的捕获率小于62.5%。每耳的捕获率分布如图2A所示。24例（24/43，55.81%）的双侧捕获率大于或等于62.5%（5/8），11例（11/43，25.58%）的单耳捕获率大于或等于62.5%，8例（8/43，18.60%）的双耳捕获率小于62.5%。从0.75至8 kHz各频率的捕获率分别为41.25%、50.60%、63.75%、75.00%、75.00%、77.11%、80.25%和74.39%（图2B）。

打开多媒体模式 图2. 打开多媒体模式 患者DPOAE首次检查结果及随疾病进展的变化。A，上方柱状图显示首次检查各耳DPOAE捕获率的分布，下方柱状图显示首次检查各患者DPOAE捕获的分布。对每耳，捕获率=信噪比≥6 dB的检测频率数/总检测频率数（8）。对每位患者，引出反应定义为该耳超过半数频率的信噪比≥6 dB，即该耳的引出率≥62.5%（5/8）。B，首次检查不同测试频率下的DPOAE捕获率。C，DPOAE首次和随访结果比较。每个点代表每位患者的结果，中间横线代表中位数，上方和下方短线分别代表上四分位数和下四分位数。D，每位患者DPOAE首次和随访结果的变化。每种颜色代表一位患者的结果。E，DPOAE每个测试频率的捕获率首次和随访结果比较。F，各测试频率的DPOAE捕获率随年龄的变化。*p < 0.05。DPOAE表示 distortion product otoacoustic emission（畸变产物耳声发射）；n，耳数。

38例患者（76耳）接受了ASSR测试（图3A）。7例患者（12耳）接受了ECochG测试，记录并标注了总和电位（SP）和动作电位（AP）。3耳（3/12，25.00%）的-SP/AP比值在0.4至1之间，8耳（8/12，66.67%）比值大于1.0，1耳（1/12，8.33%）未记录到SP或AP波形（图S2B见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。SP平均幅度为0.96 ± 0.91 μV，AP平均幅度为0.73 ± 0.61 μV，SP/AP平均幅度比值为1.61 ± 1.08（表1）。

**表1. 耳蜗电图的幅度及幅度比**

| 患者ID | 左耳/右耳 | -SP幅度/μV | AP幅度/μV | -SP/AP幅度 |
|--------|-----------|------------|-----------|------------|
| 400695 | 左耳 | 0.39 | 0.27 | 1.43 |
| | 右耳 | 0.81 | 0.17 | 4.77 |
| 1006862 | 左耳 | 0.63 | 0.72 | 0.88 |
| | 右耳 | 0.53 | 0.92 | 0.58 |
| 1006754 | 左耳 | 0.82 | 0.41 | 2.02 |
| | 右耳 | 1.19 | 0.8 | 1.51 |
| 1007033 | 左耳 | 1.02 | 0.97 | 1.05 |
| 1006802 | 左耳 | 无反应 | 无反应 | NA |
| 702715 | 左耳 | 0.34 | 0.2 | 1.76 |
| | 右耳 | 0.12 | 0.09 | 1.26 |
| 804802 | 左耳 | 1.01 | 1.28 | 0.79 |
| | 右耳 | 3.68 | 2.25 | 1.63 |
| 平均±标准差 | | 0.96 ± 0.91 | 0.73 ± 0.61 | 1.61 ± 1.08 |

AP，动作电位；NA，不可用；NR，无反应；SP，总和电位。

打开多媒体模式 图3. 打开多媒体模式 患者主观/客观听阈测试的首次检查结果及随疾病进展的变化。A，左侧显示ASSR左耳阈值，右侧显示ASSR右耳阈值（首次检查）。虚线代表每位患者的情况，实线连接各频率的均值，绿色虚线为温度敏感型患者的听阈。B，左侧显示纯音测听的左耳阈值，右侧显示纯音测听的右耳阈值（首次检查）。虚线代表每位患者的情况，实线连接各频率的均值，绿色虚线代表温度敏感型患者的听阈。C，ASSR首次和随访结果比较。实心圆点代表中位数，上方和下方短线分别代表上四分位数和下四分位数。D，纯音听阈首次和随访结果比较。实心圆点代表中位数，上方和下方短线分别代表上四分位数和下四分位数。E，每位患者纯音平均听阈首次和随访结果的变化。每种颜色代表一位患者的结果。*p < 0.05，**p < 0.01。ASSR表示 auditory steady-state response（听性稳态反应）；n，耳数。

23例患者（45耳）接受了纯音测听或行为测听，平均听阈为89.20 ± 17.81 dB HL（图3B），其中1耳（1/45，2.22%）为中度，3耳（3/45，6.67%）为中重度，8耳（8/45，17.78%）为重度，12耳（12/45，26.67%）为极重度，21耳（21/45，46.67%）为全聋。大多数患者（21/22，95.55%）双耳听力对称或听阈差异在15 dB以内。听力图类型方面，11耳（11/44，25.00%）为平坦型，11耳（11/44，25.00%）为上斜型，9耳（9/44，20.45%）为下斜型，8耳（8/44，18.18%）为U型，3耳（3/44，6.82%）为峰型，2耳（2/44，4.55%）为其他类型。40例患者（80耳）接受了鼓室图测试，其中52耳（52/80，65.00%）显示"A"型曲线，28耳（28/80，35.00%）显示"As"型曲线。39例患者（78耳）进行了声反射测试，所有病例同侧和对侧反射均缺失。

对28例患者（55耳）的纯音或行为测听与DPOAE进行了相关性分析。Spearman相关性分析显示，平均听阈与DPOAE捕获率之间无显著关系（R = 0.103，p = 0.456）。对25例患者（49耳）的纯音或行为测听与ASSR结果进行分析，测听与ASSR在500、1000、2000和4000 Hz各频率阈值之间无显著关系（0.5 kHz：R = 0.232，p = 0.109；1 kHz：R = 0.070，p = 0.632；2 kHz：R = 0.214，p = 0.141；4 kHz：R = 0.114，p = 0.435）。

**自然病程**

15例患者（27耳）接受了DPOAE随访。随访期从0.17至3.58年，首次检查的平均年龄为1.70 ± 0.82岁，复查的平均年龄为2.95 ± 1.43岁（t = ?2.742，p = 0.012）。首次检查的中位捕获率为62.50%（37.50%，87.50%），复查的中位捕获率为50.00%（25.00%，75.00%），差异具有统计学意义（Z = 2.077，p = 0.048）（图2C）。首次评估时，17耳（17/27，62.96%）捕获率≥62.5%，10耳（10/27，37.04%）<62.5%。再评估时，13耳（13/27，48.15%）捕获率≥62.5%，14耳（14/27，51.85%）<62.5%。两次评估之间差异无统计学意义（p = 0.388；表S4见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B852）。年平均下降率为17.35%。在27耳中，6耳（22.22%）捕获率升高，15耳（55.56%）捕获率下降，6耳（22.22%）无变化（图2D）。各频率的捕获率均有下降，但仅在0.75 kHz（p = 0.007）和1 kHz（p = 0.017）差异具有统计学意义，其他频率无统计学显著差异（图2E）。拟合了捕获率随年龄变化的线性方程（图2F），Spearman相关性分析显示捕获率与年龄之间的相关性具有统计学意义（p = 0.001，R = ?0.329）（图S3A见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。

19例患者（38耳）接受了ASSR随访。随访期从0.25至4.75（1.36 ± 1.39）年。首次检查的平均年龄为1.35 ± 0.69岁，复查年龄为2.71 ± 1.44岁（t = ?3.712，p = 0.001）。从0.5至4 kHz各频率在首次和再评估之间的阈值变化差异具有统计学意义（图3C）。0.5至4 kHz听阈的年平均增加量分别为9.56、1.99、4.30和14.10 dB（表S5见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B852），各耳听阈变化见图S3B（补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。拟合了0.5至4 kHz各频率听阈随年龄变化的线性方程（图S3B见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。Spearman相关性分析显示，各频率听阈与年龄之间的相关性具有统计学意义（0.5 kHz：p = 0.004，R = 0.258；1 kHz：p = 0.008，R = 0.235；2 kHz：p = 0.008，R = 0.235；4 kHz：p < 0.001，R = 0.343）（图S3B见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。

15例患者（28耳）接受了纯音测听随访，随访期为0.17至9.83（2.31 ± 2.73）年，首次检查年龄为1.75（1.33，2.50）岁，复查年龄为3.08（2.04，5.08）岁（Z = ?2.516，p = 0.012）。首次检查的平均听阈为91.56 ± 13.91 dB HL，复查时为93.94 ± 11.76 dB HL（t = ?0.801，p = 0.430）。除8 kHz阈值在首次检查和复查之间差异具有统计学意义外（Z = ?2.098，p = 0.036），其他频率无显著差异（图3D）。平均听阈每年增加1.34 dB，其中18耳（18/28，64.29%）听阈升高，10耳（10/28，35.71%）听阈下降（图3E）。Spearman相关性分析显示，平均听阈与年龄之间无统计学显著相关性（p = 0.896，R = ?0.014）（图S3C见补充数字内容，https://links.lww.com/EANDH/B853）。

28例患者通过问卷评估了前庭功能。在28例成功随访的患者中，未观察到显著的前庭异常，包括患者1607625，其报告与植入式耳蜗编程不适相关的短暂头晕，适应后消失，其VAS、DHI和VSS-C评分均为0；患者1607480和2008553报告轻微头晕（VAS = 1），对生活方式感知影响极小，其他量表（DHI、VSS-C）评分为0；患者400250表现出轻度症状负担（DHI = 22；VSS = 42），其DHI评分主要与体位因素有关。VSS-C量表的回答表明眩晕发作频率较低；无法确认该患者存在前庭功能障碍。

1006754号患者评分较低（DHI = 4；VSS-C = 5），其DHI和VSS-C评分主要源于快速头部运动引发的头晕感，且此类情况偶尔发生。

干预

34例患者（34/43，79.07%）在随访时告知了干预方式，其中2例（2/34，5.88%）为双侧人工耳蜗植入（CI），8例（8/34，25.53%）为CI+助听器（HA），15例（15/34，44.12%）为单侧CI，2例（2/34，5.88%）为双侧HA，7例（7/34，20.59%）未接受任何干预（图4A）。10例患者（17耳）记录了干预前后的听力阈值（补充数字内容图S4，https://links.lww.com/EANDH/B853），其中包括13耳HA和4耳CI，HA干预下阈值改善为29.58（18.75，36.25）dB，CI干预下改善为73.75（45.00，81.25）dB。

开放多媒体模式 图4. 开放多媒体模式 患者干预方法及疗效评估。A，患者中干预方法的分布。B，患者中CAP和SIR评分的分布。C，植入年龄与CAP评分及SIR评分的散点图及线性方程拟合，分别为。D，植入时长与CAP评分及SIR评分的散点图及拟合线性方程，分别为。CAP指听觉表现类别；CI，人工耳蜗植入；HA，助听器；N，患者数量；SIR，言语智能评级。

在25例接受CI的患者中，首次植入年龄为3.00（2.00，4.00）岁，干预时长为3.50（2.25，6.00）年，平均听觉表现类别（CAP）评分为7.00（5.00，7.50），言语清晰度评级（SIR）评分为4.00（3.00，4.50）（图4B）。CI患者的CAP评分与植入年龄呈负相关（p = 0.747，R = ?0.071），与植入时长成正比（p = 0.001，R = 0.652）。SIR评分与植入年龄呈负相关（p = 0.278，R = ?0.236），与植入时长成正比（p = 0.016，R = 0.497）（图4C、D）。

11例患者（20耳）记录了干预一段时间后的DPOAE变化，其中包括17耳HA和5耳CI。17例HA干预的随访期为0.83（0.33，1.67）年，范围为0.17至5.58年，平均年下降率为6.05%，其中9耳提取率降低，5耳提取率升高，3耳提取率无变化。HA干预患者的DPOAE提取率为63%（50%，88%），非干预患者为63%（38%，75%），差异无统计学意义（Z = ?0.224，p = 0.823）（补充数字内容表S6，https://links.lww.com/EANDH/B852）。4例CI患者（5耳）中，3耳CI前后DPOAE提取率下降，2耳无变化（补充数字内容表S7，https://links.lww.com/EANDH/B852）。

基因型与表型相关性分析

根据双等位基因功能丧失突变的组合，11例（11/43，25.58%）双等位基因均为Lof变异（LL），21例（21/43，48.84%）为一侧错义变异和一侧Lof变异（ML），11例（11/43，25.58%）双等位基因突变均为Lof变异（MM）。LL、ML或MM变异三组在年龄和性别方面无显著差异，DPOAE、纯音听阈及ASSR测试结果也无显著差异（除0.5 kHz纯音听阈外）（补充数字内容表S8，https://links.lww.com/EANDH/B852及图5）。LL组的DPOAE提取率略高于ML组和MM组。LL组0.25至1 kHz频段的阈值略优于ML组。LL组1、2和4 kHz的ASSR频率阈值略差于ML组和MM组，ML组与MM组的频率阈值相似。

开放多媒体模式 图5. 开放多媒体模式 不同基因型患者的特征——截断变异/Lof变异/C2结构域。A，TT、TN和NNt组年龄比较。B，TT、TN和NNt组性别比较。C，TT、TN和NNt组DPOAE提取率比较。D，TT、TN和NNt组纯音听阈比较。E，TT、TN和NNt组ASSR结果比较。F，LL、ML和MM组年龄比较。G，LL、ML和MM组性别比较。H，LL、ML和MM组DPOAE提取率比较。I，LL、ML和MM组纯音听阈比较。J，LL、ML和MM组ASSR结果比较。K，CC、CN和NNc组年龄比较。L，CC、CN和NNc组性别比较。M，CC、CN和NNc组DPOAE提取率比较。N，CC、CN和NNc组纯音听阈比较。O，CC、CN和NNc组ASSR结果比较。*p < 0.05。ASSR，听觉稳态反应；BA，行为测听；CC，C2结构域+C2结构域；CN，C2结构域+非C2结构域；DPOAE，失真产物声诱发射；LL，Lof+Lof；ML，错义+Lof；MM，错义+错义；N，耳数；NNc，非C2结构域+非C2结构域；NNt，非截断+非截断；PTA，纯音平均；TN，非截断+截断；TT，截断+截断。

根据双等位基因蛋白截断的组合，4例（4/43，9.30%）双等位基因突变导致蛋白截断（TT），20例（20/43，46.51%）单等位基因突变导致蛋白截断（TN），19例（19/43，44.19%）双等位基因未导致蛋白截断（NNt）。TT、TN或NNt变异三组在年龄和性别方面无显著差异，纯音听阈及ASSR测试结果也无显著差异（除4 kHz纯音听阈外）（补充数字内容表S8，https://links.lww.com/EANDH/B852及图5）。TN组的DPOAE提取率高于NNt组（p = 0.032）。TN组0.25–8 kHz频段的纯音阈值略优于NNt组。TN组与NNt组的ASSR频率阈值相似。

根据影响C2结构域的双等位基因变异组合，16例（16/43，37.21%）双等位基因变异影响C2结构域（CC），20例（20/43，46.51%）单等位基因突变影响C2结构域（CN），7例（7/43，16.28%）双等位基因突变未影响C2结构域（NNc）。CC、CN或NNc变异三组在年龄和性别方面无显著差异，DPOAE、纯音听阈及ASSR测试结果也无显著差异（除1和2 kHz的ASSR阈值外）（补充数字内容表S8，https://links.lww.com/EANDH/B852及图5）。CC组的DPOAE提取率略高于CN组和NNc组。CC组的PTA略优于CN组。CC组的ASSR阈值略优于NNc组和CN组，其中1和2 kHz的差异具有统计学意义（1 kHz：CC vs CN：p = 0.010，CC vs NNc：p = 0.002；2 kHz：CC vs CN：p = 0.003，CC vs NNc：p < 0.0001）。

讨论

OTOF基因是首个被确认与常染色体隐性非综合征型AN相关的基因（Chaib等，1996），占婴儿AN病例的41.2%（Zhang等，2016a）。与AN相关的OTOF突变受累病灶主要为突触及突触前病变（Roux等，2006；Rodriguez-Ballesteros等，2008；D. Y. Wang等，2010）。迄今为止，关于OTOF基因变异的论文共发表98篇，已报告199个OTOF基因的致病或可能致病变异，涉及31个国家或地区，其中中国人群报告72个变异和38例患者，其次为日本的45个变异和巴基斯坦的21个变异。本研究鉴定了7个致病变异或可能致病变异的新变异，扩展了OTOF基因型谱并丰富了OTOF患者群体数据。为进一步为临床管理和遗传咨询提供证据，对43例OTOF变异AN患者进行了基因型-表型相关性分析。

OTOF基因的遗传学与流行病学情况分析

本研究中最常见的变异为c.5000C>A（p.Ala1667Asp）（7/108），此前被归类为意义不确定变异。我们将其致病性升级，归类为可能致病变异（可能致病 = PM2 + PM3_Strong + PP3），未来可跟踪该位点在患者中的鉴定情况。根据既往研究，OTOF中最常见的变异为c.5816G>A（p.R1939Q），在日本（Matsunaga等，2012；Iwasa等，2013、2019、2022）、韩国（Chang等，2015；Kim等，2018）、中国（Xie等，2021）和美国（Varga等，2003）人群中均有检出。该变异被认为是日本和韩国人群中AN的常见致病变异，本研究中也检测到该变异（3/108）。第二常见变异为c.2485C>T（p.Q829X），在西班牙人群（Rodriguez-Ballesteros等，2003、2008；Gallo-Teran等，2006）、法国（Rouillon等，2006）、阿根廷（Rodriguez-Ballesteros等，2008）、墨西哥（Rodriguez-Ballesteros等，2008）和英国（Varga等，2006；Carvalho等，2016）人群中常见。然而，该变异从未在中国人群中检测到，本研究中也未检测到。OTOF c.5098G>C（p.E1700Q）在中国（台湾）人群中也具有较高的检出率（Chiu等，2010），本研究中也检测到该位点（2/108）。除热点突变差异外，OTOF变异在不同人群间表现出一致性，表型也一致。在OTOF的数百个变异中，部分变异在不同人群中均有出现，如OTOF c.2122C>T, p.R708X，在西班牙、巴基斯坦、印度、阿尔及利亚、哥伦比亚和中国人群中均有发现（Rodriguez-Ballesteros等，2003；Varga等，2006；Choi等，2009；Ammar-Khodja等，2015；Pandey等，2017；Richard等，2019；Yu等，2020；Fareed等，2021）。

OTOF基因变异相关AN患者的表型特征

本研究中，所有OTOF基因变异AN患者的发病年龄均为婴儿期（小于3岁），这与目前研究结果一致。新生儿听力普筛显示OAE反应清晰，但自动听性脑干反应无清晰应答。大多数病例表现为ABR缺失（97.67%）或明显异常（2.33%），提示听神经纤维不同步、缺乏神经活动或神经传导阻滞。CM记录率为100%，本研究中DPOAE提取率为68.60%。DPOAE和CM测试共同提示外毛细胞（OHC）功能保存。DPOAE提取率低于CM，因为DPOAE易受多种因素影响，如患者外中耳状态、测试环境及仪器适应性；DPOAE对OHC损伤更敏感；DPOAE和CM反映OHC的不同功能。在既往报告的OTOF基因变异相关AN患者中，ABR缺失率为89.83%（106/118），异常率为10.17%（12/118）（Rodriguez-Ballesteros等，2003；Varga等，2003、2006；Tekin等，2005；Gallo-Teran等，2006；Rouillon等，2006；Santarelli等，2009、2015；Zadro等，2010；L. P. Zhang等，2013；Jin等，2014；Chang等，2015；Fedick等，2016；Zhang等，2016a；Tang等，2017；Almontashiri等，2018；Chen等，2018；Kim等，2018；Y.

Wang等2018年；Wu等2018年；Qiu等2019年；Wu等2020年；Zhai等2020年；Iwasa等2022年；Jiang等2022年）。在这些研究中，OAE响应在93.13%（149/160）的耳中可被记录到（Rodriguez-Ballesteros等2003年、2008年；Varga等2003年、2006年；Tekin等2005年；Gallo-Teran等2006年；Rouillon等2006年；Santarelli等2009年、2015年；Chiu等2010年；Zadro等2010年；Iwasa等2013年、2019年、2022年；Zhang等2013年；Jin等2014年；Yildirim-Baylan等2014年；Chang等2015年；Fedick等2016年；Zhang等2016a；Tang等2017年；Almontashiri等2018年；Chen等2018年；Kim等2018年；Wang等2018年；Wu等2018年；Qiu等2019年；Wu等2020年；Zhai等2020年；Jiang等2022年），CM的记录率为100%（27/27）（Varga等2006年；Zhang等2016a；Tang等2017年；Wang等2018年；Wu等2018年；Zhai等2020年）。本研究的结果与上述研究一致。本研究中患者的ECochG有3种表现：(i) ?SP/AP振幅比大于0.4且小于1（25.00%）；(ii) ?SP/AP振幅比大于1（66.67%）；(iii) 未观察到SP和AP波形（8.33%）。SP和AP振幅存在个体差异。?SP振幅可低至0.12 μV，也可高达3.68 μV。有假说认为，低?SP振幅可能是由于神经递质在突触前膜积聚产生毒性，导致内毛细胞受损。高?SP振幅可能是由于听神经传出纤维激活减少以及内毛细胞抑制异常所致。同时存在正常的?SP振幅，提示内毛细胞功能正常。AP振幅一方面受个体差异影响，另一方面反映了神经递质突触释放功能的保留程度（McMahon等2008年；Santarelli等2008年、2009年；Rance & Starr 2015年）。Santarelli等（2015年、2021a、2021b）对OTOF阳性AN患者的ECochG分类进行了探讨：(i) 从SP开始并持续较长时间的负性电位被认为具有神经源性成分，即突触释放异常，仍有神经纤维被激活但不产生同步放电；(ii) 在SP后的持续电位中，也存在可辨识的残余复合动作电位，表明突触释放能够同步神经放电，但激活的神经纤维数量有限，因此复合动作电位振幅不高；(iii) 仅有SP存在，其后无持续电位，提示囊泡释放完全受损，几乎没有或完全无神经纤维被激活。根据此标准，本研究病例大多属于第二种模式，提示突触保留了部分递质释放能力，使有限的神经纤维能够同步放电。ASSR检测的阈值曲线呈"√"形，表明保留了高频残余听力。纯音测听/行为测听结果显示双耳基本对称（95.55%），听力损失程度分布从中度听力损失到完全聋，以重度听力损失及以上聋为主（91.11%）。听力图类型多样，包括相对常见的平坦型（25.00%）和上升型（25.00%），以及下降型（20.45%）、谷型（18.18%）和峰型或碟型（6.82%），高频听觉阈值优于中低频的趋势。声导抗测试结果显示A型或As型鼓室图，表明中耳功能正常。在既往报道的与OTOF基因变异相关的AN患者中，听力损失程度以重度及以上为主，听力图类型以平坦型为主（Rodriguez-Ballesteros等2003年、2008年；Romanos等2009年；Matsunaga等2012年；Zhang等2016a；Kim等2018年；Wu等2018年；Iwasa等2022年），与本研究结果一致。本研究的随访率为74.42%。随访期间，ASSR阈值升高，不同频率的年阈值增加量不同，4 kHz增加最大（14.10 dB HL cg），1 kHz增加最小（1.99 dB HL cg）。DPOAE的提取率随病程进展而降低，平均年降低17.35%。纯音测听阈值未见明显进展。总体而言，OTOF基因变异相关AN患者在0.25至12.17（3.31 ± 3.78）年的随访期内，自然病程未见明显进展，仅在ASSR和DPOAE检测中表现出一定程度恶化。共有36例患者（Chiu等2010年；Matsunaga等2012年；Zhang等2016a）探讨了疾病进展，其中30例（30/36，83.33%）稳定无进展，6例（6/36，16.67%）表现为听力进行性下降，表明OTOF变异相关AN患者的听力大多稳定，仅少数表现为进行性听力下降。与OTOF突变相关的温度敏感性听觉神经病病例较为独特，听力可能有所改善（Zhang等2016b）。同时，本研究分析了干预对DPOAE的影响，显示干预与DPOAE变化之间无关联。此问题存在争议，但研究提示不应因保留OAE响应而避免助听器干预（Iwasa等2022年）。本研究大多数患者（73.53%）选择了人工耳蜗植入干预，效果良好。CAP评分为7.00（5.00，7.50），SIR评分为4.00（3.00，4.50），助听后的听力阈值相比未助听时的听力阈值提高了73.75 dB（45.00，81.25）。共有18篇文献（Rodriguez-Ballesteros等2003年；Loundon等2005年；Rouillon等2006年；Chiu等2010年；Zadro等2010年；Wu等2011年；Runge等2013年；Zhang等2013年；Santarelli等2015年；Miyagawa等2016年；Zhang等2016b；Park等2017年；Chen等2018年；Hosoya等2018年；Kim等2018年；Wu等2018年；Lee等2021年；Wu等2023年）报道了OTOF基因变异相关AN患者的人工耳蜗植入干预，涉及7个国家67例患者。对于干预效果，人工耳蜗下的助听阈值为25至45 dB，优于助听器干预的75 dB（Loundon等2005年；Rouillon等2006年；Zhang等2013年、2016b；Chen等2018年）。听觉表现类别（CAP）在植入年龄小于2年时为6至7分，植入年龄大于2年时为3至4分（Park等2017年），植入年龄小于18个月的患者改善速度快于植入年龄大于18个月的患者（Kim等2018年）。植入时间在1年内为4至5分，2年后为4至7分，3年后为7分（Wu等2011年；Kim等2018年）。与GJB2和SLC26A4基因变异及巨细胞病毒感染引起的听力损失患者相比，人工耳蜗植入后的CAP评分无差异（Hosoya等2018年；Wu等2018年）。部分学者以植入年龄2年和植入时间1年为界限讨论人工耳蜗植入干预效果（Park等2017年；Kim等2018年；Lee等2021年）。本研究根据此标准进行分析，发现OTOF基因变异相关AN患者在2岁以内植入且干预超过1年的患者效果更好。此外，干预时间的影响在本研究中似乎更为显著，这可能是由于植入年龄数据分布较窄且干预时间数据跨度相对较大所致。既往研究表明截短变异与重度至极重度听力损失相关（Iwasa等2022年）。错义/错义（MM）或错义/功能丧失（ML）变异患者的听力阈值优于功能丧失/功能丧失变异（LL）患者（Thorpe等2021年）。本研究以三种方式对患者变异类型组合进行了分类，观察到一定趋势。功能丧失和截短变异与更差的听力阈值但更好的DPOAE激发相关。影响C2结构域的变异似乎与更好的听力阈值和DPOAE激发相关。然而，未发现显著的统计学差异，这可能是由于样本量不足所致。具体机制及导致此种趋势的原因尚未阐明，有待进一步研究。既往研究发现功能丧失变异倾向于与更差的听力阈值相关（Thorpe等2021年），TT组患者重度听力损失的比例更高（Iwasa等2022年），与上述报告一致（p = 0.027）。然而，影响C2结构域的变异结果不一致。CC组患者似乎与更差的听力表型相关，但听力损失分布仅与单等位基因C2结构域变异患者不同（p = 0.010）。因此，C2结构域相关变异与表型之间的关联仍需进一步探索。本研究存在以下局限性：由于无患者描述前庭功能障碍症状（如眩晕、平衡障碍），原始研究方案中未对这些个体进行常规前庭功能检测。为进一步随访全部43例患者的前庭症状，进行了电话随访以补充前庭功能信息。在随访患者中，未报告显著的前庭症状。我们将在后续随访门诊中进一步强调前庭症状询问，并进行视频头脉冲试验和前庭诱发肌源性电位等相应检查。总之，本研究阐明了OTOF变异相关AN患者的表型和基因型特征，以及其自然病程和干预效果。鉴定了7个OTOF基因新突变，丰富了OTOF基因变异谱。在6个无亲缘关系患者家族中发现复发性位点c.5000C>A（p.Ala1667Asp），可能是AN患者的热点突变。大多数OTOF变异相关AN患者表现为重度至极重度听力损失，随病程进展而发展。人工耳蜗植入效果良好，与干预年龄和干预时间相关。基因型与表型相关性分析提示不同基因型分类可能与不同表型特征相关，为临床管理、基因筛查和遗传咨询提供了证据。致谢 作者感谢参与本研究的患者及其家属，感谢提供公开数据的作者以及所使用的在线分析工具。