《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Modelling Tetralogy of Fallot: insights and limitations of animal models
法洛四联症（Tetralogy of Fallot, TOF）是最常见的发绀型先天性心脏病，其发病机制源于流出道（outflow tract, OFT）形态发生过程中漏斗隔的头前位偏移，进而形成室间隔缺损、主动脉骑跨、肺动脉狭窄及右心室肥厚四大解剖特征。尽管外科矫治技术已取得显著进展，TOF的发育起源仍未完全阐明，且大多数非综合征型病例的遗传架构尚待解析。实验模型是推动该领域进展的核心工具，但单一模型往往仅能复现疾病的部分表型。本综述按物种心血管结构与人类的相似度递增顺序，系统评估了跨物种的TOF动物与遗传模型。斑马鱼与爪蟾（Xenopus）虽存在心脏解剖结构的本质差异，但可实现候选基因与保守发育通路的快速体内验证。鸟类模型在明确第二心场（second heart field, SHF）及心脏神经嵴细胞（cardiac neural crest cells, cNCCs）对OFT延长与分隔的贡献方面发挥了关键作用。小鼠模型因具备四腔心结构且易于进行精准遗传修饰，为机制研究提供了最详尽的见解，研究人员对多条信号通路的关键模型进行了深入剖析。研究反复发现，单一模型多仅能复现TOF四联征的离散组分，而非完整表型，常表现为右室双出口（double outlet right ventricle, DORV）或永存动脉干（persistent truncus arteriosus, PTA），而非经典TOF。目前尚无单一模型能以完全外显率复现全部四大特征。未来需持续整合人类基因组数据与靶向实验干预，以填补这一空白。
1 引言
法洛四联症（TOF）作为一种先天性心脏病（congenital heart disease, CHD），其临床识别历史已逾三个世纪。TOF是最常见的发绀型先天性心脏疾病，活产儿发病率约为3/10,000，占全球CHD病例的5%–10%。其高患病率与严重的临床表型使其成为先天性心血管研究的焦点，推动了心脏外科与发育心脏病学的重大进展。在外科干预出现前，仅24%的TOF患儿能存活至10岁；如今，接受手术治疗的TOF患者可存活至中老年，但仍需终身监测以防范残余心功能不全。TOF的历史重要性、流行病学特征及病因复杂性，推动了多种旨在复现其解剖、分子与功能特征的实验模型的发展。
1.1 解剖特征与临床意义
人类TOF的四大缺损源于胚胎早期（妊娠4–8周）流出道（OFT）与圆锥干分隔过程。具体包括室间隔缺损（ventricular septal defect, VSD）、OFT梗阻导致的肺动脉干狭窄、主动脉骑跨（ overriding aorta, OA）以及右心室代偿性肥厚（right ventricular hypertrophy, RVH）。胚胎发育中，心脏神经嵴细胞（cNCCs）与第二心场（SHF）祖细胞协同调控OFT延长与分隔为升主动脉与肺动脉。漏斗隔的头前位偏移常伴隔-壁小梁肥厚，是TOF特征性病变的基础。漏斗隔错位导致大型非限制性VSD与主动脉骑跨，此时主动脉根部横跨室间隔，同时接收双心室血液。当隔错位合并肺动脉下OFT漏斗部（infundibular）狭窄时，即形成右心室流出道（right ventricular outflow tract, RVOT）梗阻。这种慢性压力负荷最终引发右心室肥厚，构成解剖四联征。RVOT梗阻可发生于漏斗部、瓣膜或肺动脉分支水平，其严重程度是决定临床结局的核心因素。肺血流阻力升高使右心室压力超过左心室，导致VSD处右向左分流，脱氧血液混入体循环引发发绀，这是TOF的标志性表现。右心室通过代偿性肥厚适应压力负荷。临床上TOF呈谱系分布：无发绀型TOF因梗阻轻微，以左向右分流为主，氧合接近正常；而严重梗阻或合并肺动脉闭锁（TOF/PA）者则自出生即出现重度发绀。术前婴幼儿及姑息术后成人患者中，漏斗部梗阻的动态变化可诱发“法洛四联症缺氧发作”（Tet spells），即肺血流急性减少与全身氧饱和度下降。这些血流动力学后果凸显了RVOT梗阻作为疾病严重程度关键决定因素的地位。尽管完全外科矫治已成为婴儿期常规操作，但肺动脉反流、心律失常及心源性猝死等长期并发症仍持续存在。因此，结构错位、可变流出道梗阻与继发性肥厚的相互作用，共同解释了TOF的解剖复杂性与临床异质性。理解这些机制为评估旨在复现TOF发育起源与病理生理特征的实验模型奠定了基础。
1.2 遗传学基础
TOF的遗传异质性显著，涉及染色体综合征及大量干扰心脏发育通路的基因突变。约20%的TOF病例发生于明确综合征或染色体异常背景下，典型例子包括唐氏综合征（21三体）、特纳综合征（45,X），以及高CHD外显率的微缺失如迪乔治综合征（22q11.2缺失）。TOF也可由单基因病引起，如由JAG1（94%–97%病例）和NOTCH2（1%–3%病例）缺失或变异导致的Alagille综合征。80%的TOF病例为非综合征型（孤立性），无明确细胞遗传学病因。近二十年的研究已鉴定出一系列与非综合征型TOF相关的基因变异，包括参与心管延伸与分隔的转录调控因子NKX2.5、GATA4、TBX5、JAG1（Jagged1）、ZFPM2（FOG2）等有害突变。这些基因汇聚于调控右心室流出道区域模式形成的关键通路，例如源自SHF的TBX1及神经嵴细胞中的Jagged/Notch信号均参与OFT分隔。
2 综述范围
鉴于TOF的解剖复杂性，亟需从非哺乳类脊椎动物模型到遗传工程小鼠的多样化实验策略，以阐明其发病机制。本综述的结构基于当前将TOF与右室双出口（DORV）视为OFT对位缺陷谱系的观点，该谱系源于OFT延长、旋转、分隔及重塑过程的扰动。研究人员通过PubMed、Web of Science和Scopus，使用“Tetralogy of Fallot”“conotruncal”“outflow tract”及文中涉及的物种与基因名组合进行文献检索，覆盖截至2025年9月的发表成果。重点聚焦于通过遗传或手术干预产生与TOF相关的OFT对位异常的模型，涵盖斑马鱼、爪蟾、鸡和小鼠。对于同一基因构建的多个动物模型或遗传修饰，优先呈现最贴近TOF核心特征的模型。本综述聚焦TOF的动物与遗传模型，而非其人类遗传架构或非遗传病因。人类TOF相关基因变异已在他处详述，表观遗传及环境因素（包括母胎microRNA轴）亦不在本综述范围内。本综述按心脏解剖与生理相似性递增顺序（从斑马鱼到小鼠）讨论各模型系统，突出每种模型在研究TOF不同方面的互补优势。研究人员重点剖析遗传模型，尤其是凸显TOF关键基因与分子通路的工程小鼠突变体。通过关联这些互补系统的研究发现，旨在全面总结TOF的发育机制。尽管尚无单一实验模型能完全复现人类TOF的解剖与遗传复杂性，但这些解剖、手术与遗传学方法所获得的见解，正持续深化对TOF发育起源的理解，并有望为未来的治疗或预防策略提供依据。
3 跨物种动物模型
为阐明包括TOF在内的CHD发育机制，过去数十年已应用了广泛的动物模型。斑马鱼、爪蟾与鸡胚均为可开展心脏发育研究的脊椎动物模型，尽管其心脏结构与哺乳动物存在显著差异。斑马鱼为两腔心，爪蟾为三腔心，而鸡心为四腔心，其心脏形态发生过程与哺乳动物高度相似。小鼠模型则在常用实验系统中最接近人类心血管发育。以下依次讨论各模型系统，突出其在TOF研究中的优势、局限性与应用。
3.1 斑马鱼模型
斑马鱼是低成本、高通量的心脏发育遗传研究模型。其体外受精、胚胎发育迅速、光学透明及高产仔量的特性，使其特别适合大规模遗传筛选。约70%的人类蛋白编码基因在斑马鱼中至少存在一个直系同源基因，这一优势推动了大规模ENU诱变筛选，鉴定出大量参与脊椎动物心脏发育的基因，确立了斑马鱼作为心血管研究主要模型的地位。然而，斑马鱼在模拟TOF解剖特征方面存在显著局限：其心脏仅含单心房与单心室，缺乏室间隔，无法真实复现VSD与主动脉骑跨等缺损。此外，斑马鱼OFT包含球状动脉窦（bulbus arteriosus），与哺乳动物OFT差异显著，无法复现人类TOF涉及的复杂分隔与瓣膜结构。尽管如此，斑马鱼在候选基因筛选与功能验证方面仍具极高价值。心脏发育异常如环化缺陷与心双畸型易于识别，且早期胚胎因依赖氧扩散，即使在严重心血管功能障碍下仍可存活数天，便于详细表型分析。通过吗啉代寡核苷酸敲低、mRNA过表达、CRISPR介导的诱变及挽救实验，可快速评估基因在心脏发育中的功能。例如，斑马鱼血血管心外膜物质（blood vessel epicardial substance, BVES）吗啉代敲低模型表现出显著的心脏环化缺陷与心室流出道（ventricular outflow tract, VOT）狭窄，伴随SHF中转录因子Nkx2.5与Gata4表达降低，这些分子改变与携带BVES突变患者的报道相似。因此，斑马鱼特别适用于鉴定与CHD及TOF发病相关的候选基因，但疾病机制与解剖表型的确认通常需依赖更复杂的脊椎动物模型。
3.2 爪蟾模型
爪蟾模型在发育生物学与心血管研究中应用广泛。其胚胎体积大、体外发育、易于显微注射及胚胎发生过程清晰，使其成为心脏发育早期功能获得与缺失研究的理想系统。然而，爪蟾作为TOF模型存在重要局限：其心脏由两心房与单心室构成，OFT分隔不完全。此外，物种特异性的心脏发育差异（如缺乏神经嵴细胞对OFT分隔的贡献）使其无法完全复现人类TOF的解剖复杂性。尽管存在这些局限，爪蟾在解析CHD与圆锥干畸形的遗传基础方面仍具价值，尤其适用于对人类研究中鉴定的候选基因进行功能扰动。表达人类TOF患者携带的NKX2.5突变，可在爪蟾中诱发房间隔缺损（atrial septal defect, ASD）与瓣膜发育异常，模拟患者的心脏表型。在chd7缺陷模型中，爪蟾胚胎表现出神经嵴迁移受损，部分复现了CHARGE综合征患者的心血管表现，包括TOF。因此，与斑马鱼类似，爪蟾是验证CHD与TOF相关候选基因及发育通路的有效平台，可快速评估人类遗传研究中发现的变异功能后果。
3.3 鸟类（鸡）模型
鸡胚是经典的TOF手术模型。与人类相似，禽类心脏发育为四腔心与分隔完全的OFT，尽管其形态发生的时间与规模存在物种差异，鸡胚仍是模拟TOF等圆锥干缺陷的宝贵模型。首个成功的鸡TOF模型建于1985年，通过在Hamburger-Hamilton（HH）17–21期胚胎的圆锥心室沟放置丝线，机械性干扰被认为可延迟沟的正常回缩并损害OFT重塑。在397个手术胚胎中，仅26个存活至HH35期，其中22个出现心脏畸形。86%存在肺动脉狭窄，50%呈现OA、肺动脉狭窄与VSD的组合，与人类TOF相似。二十年后，另一种在HH14期消融SHF的手术方法获得了可比结果：76%的手术鸡胚出现心脏缺损，包括肺动脉狭窄、肺动脉闭锁与OA，部分胚胎还表现出间隔错位、VSD，严重者合并冠状动脉异常。Aranega等（1985）的模型证实，机械干扰圆锥心室沟可稳定产生TOF样解剖结构，为更靶向的方法奠定了基础。随后Ward等在HH14期消融SHF的研究揭示，SHF来源的细胞贡献于远端心肌，促进OFT延长与正确旋转。与此一致，鸡神经嵴消融通过继发性阻止SHF来源心肌进入OFT，导致PTA、DORV或TOF样解剖。这些发现凸显了SHF来源心肌对OFT延伸不足，是人类TOF室间隔错位、大动脉对位异常与OFT梗阻的关键发育机制。目前，尽管鸡胚通常不用于确立CHD的遗传基础（部分原因是稳定种系遗传修饰技术不如小鼠与斑马鱼成熟），但其易于进行时空可控的实验操作，仍非常适合分析OFT发育的细胞与形态发生机制。
3.4 小鼠模型
实验室小鼠是圆锥干心脏缺损及广义CHD遗传研究的基石，因其四腔心结构与人类心脏解剖高度相似，且易于实现稳定种系遗传修饰。该方法可直接评估特定遗传改变如何影响心脏发育并导致结构缺损。大量工程小鼠品系表现出圆锥干畸形，包括OFT对位异常、分隔缺陷与室间隔形成异常。然而，这些表型常属于更广泛的OFT对位异常谱系，部分病例更近似右室双出口（DORV）变异型，而非经典人类TOF。尽管部分突变体的早期胚胎致死与物种差异增加了结果解读难度，小鼠仍是解析TOF及相关圆锥干缺损遗传基础不可或缺的系统。本综述将符合至少三项TOF核心特征（室间隔缺损、主动脉骑跨、肺动脉狭窄/闭锁、右心室肥厚）的模型称为TOF模型；而以DORV、PTA或大动脉转位为主要病变的模型则描述为TOF样或圆锥干对位缺陷，而非完整TOF模型。其余表型均沿用原始文献的分类描述。
3.4.1 Notch家族
Notch信号通路在TOF及相关圆锥干心脏缺损发病中的作用已得到充分证实。研究表明，Notch信号通过调控神经嵴细胞（NCCs）群体与内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT），协调心脏发育中的多种细胞过程。在小鼠胚胎第8.5天（E8.5）左右，源自背神经管的特殊NCC亚群——心脏神经嵴细胞（cNCCs）开始迁移，穿过咽弓进入动脉干（truncus arteriosus, TA），参与OFT间隔与肺动脉垫的形成。同时，受Notch信号调控的内皮细胞经历EndMT，这一过程对心脏垫形成、瓣膜形态发生与发育至关重要。Notch通路关键组分（包括受体如Notch1、配体如Jagged1、转录抑制介导因子如Hey2、Hes1及受体激活介导因子如Adam10）的破坏，会导致人类与小鼠TOF中常见的复杂结构缺损。多种Notch通路突变的基因工程小鼠模型可复现TOF的关键特征，包括VSD、OA与肺动脉狭窄。
3.4.1.1 Hey2?/?
Hey2?/?突变小鼠出现致死性心脏畸形，呈现类似人类圆锥干心脏缺损与TOF的CHD谱系。值得注意的是，所有检测的Hey2?/?胚胎均表现出膜周部VSD伴OA，但肺动脉狭窄与OFT梗阻仅在约40%病例中共同存在。尽管这种缺损组合构成了TOF的核心解剖结构，但其外显率具有背景品系依赖性，混合背景中完全TOF的发生率较低。严重病例中，Hey2?/?胚胎还出现三尖瓣闭锁、二尖瓣增厚及TOF中罕见的房间隔缺损（ASD）等分隔缺陷。Hey2?/?突变小鼠出生后可观察到右室与左室肥厚，但因该品系早期死亡率高，相关记录较少。总体而言，Hey2?/?小鼠的缺损类似于人类JAGGED1基因突变（Alagille综合征）所致病变，通常呈现TOF四项特征中的三项（VSD、OA与OFT梗阻），罕见病例满足全部四项标准。尽管在人类CHD患者中已鉴定出HEY2变异，但其作为人类TOF直接病因的证据仍有限，凸显了模拟圆锥干缺损时小鼠与人类表型不一致这一公认挑战。HEY2是Notch信号下游的转录抑制因子，可结合心脏转录因子GATA4，抑制GATA4依赖的基因激活。
3.4.1.2 Notch1+/?;Nos3?/?
Notch1杂合合并Nos3纯合缺失的复合突变小鼠是另一类部分复现TOF核心特征的Notch家族信号相关模型。单独而言，这些突变不适用于TOF研究：Notch1?/?胚胎因严重血管缺陷在E10（OFT分隔前）死亡；Notch1+/?小鼠心脏发育缺陷轻微或无表现。而Nos3?/?小鼠虽出现VSD与半月瓣增厚，但OA、肺动脉狭窄与右心室肥厚的报道频率不一致。二者联合突变则协同导致OFT畸形谱系，包括E18.5时的二叶式主动脉瓣（bicuspid aortic valve, BAV）、半月瓣狭窄、膜周部VSD与OA。Notch1+/?;Nos3?/?小鼠同时存在显著的胚胎与围产期致死率（约65%，至出生后第10天），限制了作为OFT梗阻继发性后果的右心室肥厚的进展观察。重要的是，该小鼠模型的心血管表型不仅满足TOF四项经典组分中的三项（VSD、OA及与肺动脉瓣膜狭窄一致的瓣膜增厚），且与携带Notch1突变的人类患者所见缺损相符。这一双突变模型强调了Notch1信号在内皮细胞OFT发育中的重要作用，以及其与Nos3共同破坏时对TOF相关心脏畸形的贡献。
3.4.1.3 Jagged1（J1ECKO）
心脏发育过程中，Notch配体Jagged1（Jag1）表达于冠状动脉、第二心场与神经嵴细胞。除其在Alagille综合征中的既定作用外，JAG1点变异也在非综合征型TOF中被报道。约3%（2/94）的非综合征型TOF病例队列中发现功能相关的JAG1序列改变，且c.765C>T变异在伊朗人群TOF中呈强关联（60.2% vs 对照组5.7%）。JAG1改变与TOF的关联机制尚不明确，使其成为小鼠研究的重要靶点。早期区室特异性灭活Jag1导致E10.5前致死，因此研究人员使用VE-Cadherin-Cre驱动子在内皮细胞中删除Jag1（J1ECKO）以研究后期阶段。这种嵌合缺失复现了Alagille综合征的心脏组分：J1ECKO突变胚胎出现VSD、OA、RVH及伴狭窄的瓣膜畸形与冠状动脉异常。在46个检测的胚胎与新生鼠中，47.8%存在至少一种心脏缺损，以主动脉骑跨最常见（30.4%）。外显率可变反映了VE-Cadherin-Cre驱动子的嵌合活性，许多突变体可存活至成年，其中半数出现超出发育四联征的瓣膜钙化。该模型极具信息量，因其将Alagille核心基因直接与TOF样解剖关联，且在存活动物中观察到胚胎致死模型中罕见的RVH。
3.4.2 VEGF120/120
VEGF120/120小鼠模型通过工程化仅表达VEGF120（血管内皮生长因子A）蛋白亚型，成为间接Notch通路模型，通过Vegf-Notch信号交互失调部分复现TOF。该模型最初用于研究VEGF在骨骼发育中的作用，后被发现高度易感TOF样缺损，包括肺动脉狭窄与VSD。具体而言，VEGF120/120小鼠胚胎因漏斗隔错位导致主动脉下VSD与主动脉右位。van den Akker（2007）在E14.5–E19.5胚胎中将32%（10/31）归类为DORV，当合并右室流出道狭窄时，29%（9/31）归类为TOF。肺动脉干与动脉发育不全常见（61%，19/31），严重者进展为肺动脉干近完全闭锁。该模型与人类TOF合并肺动脉闭锁（TOF/PA）的研究高度相关，因部分VEGF120/120胚胎在宫内发育过程中从肺动脉狭窄进展为肺动脉闭锁。VSD、OA与严重肺动脉狭窄的组合直接关联于VEGF信号异常及随后OFT中Notch1与Jagged2的异位激活，后者导致漏斗隔错位与心内膜垫过度增生。综上，VEGF120/120小鼠模型复现了TOF三项核心特征（VSD、OA与肺动脉狭窄），并独特地捕获了部分胚胎向肺动脉闭锁的进展，但因围产期致死，右心室肥厚未被观察到。
3.4.3 Robo1I270T/I270T
ROBO信号受体通过与SLIT配体相互作用，为cNCC迁移至流出道提供关键导向线索，促进室间隔分隔及房室与半月瓣形成。机制上，Slit-Robo信号还调控垫形成过程中的NOTCH活性，表现为Robo1?/?小鼠心内膜垫中Notch受体及下游靶点Hey/Hes表达降低。通过ENU诱变筛选鉴定的Robo1I270T/I270T小鼠模型，报道存在膜周部VSD、OA与DORV，部分复现了TOF特征的OFT对位异常与分隔缺损。有趣的是，新生突变Robo1I270T/I270T小鼠还出现ASD、房室间隔缺损（AVSD）及腭裂、小颌等颅面异常，与人类de novo ROBO1变异携带者的心脏与颅面特征吻合。目前仅有一篇文献描述该模型表型，因缺乏存活与致死数据及肺动脉狭窄、右心室肥厚相关信息，无法对这些方面得出确切结论。尽管存在局限，Robo1I270T/I270T小鼠模型与人类ROBO1变异携带者的表型重叠，支持ROBO1作为圆锥干CHD的候选基因，但需进一步研究以确立其在TOF中的致病作用。
3.4.4 Cited2?/?
CITED2是心脏发育（包括心脏形态发生与血管形成）必需的转录调节因子。Cited2?/?小鼠是已确立的遗传模型，呈现包括TOF特征性OFT畸形在内的圆锥干缺损谱系。Cited2?/?胚胎出现外脑畸形及ASD、VSD、OA与OFT对位异常（包括DORV或动脉干，TA）等严重畸形。该模型的胚胎致死时间可变，取决于心脏缺损严重程度：许多Cited2?/?胚胎因严重心脏畸形于妊娠中期（E10.5-E14.5）死亡，但部分表型较轻者可存活至妊娠晚期。重要的是，存活至妊娠晚期（E17.5）的胚胎中报道了心室肥厚。然而，原始研究未明确说明这种肥厚是否与TOF其他三项关键特征（VSD、OA与OFT梗阻）在同一胚胎中同时出现。因此，尽管Cited2?/?模型复现了TOF的单个标志性特征，但完整四联征尚未被记录为在同一胚胎中同时发生。人类TOF患者中也鉴定出CITED2编码区与启动子区突变，其OFT与分隔畸形与Cited2?/?小鼠的分子缺陷吻合。人类与小鼠中CITED2功能缺失通过Nodal/PITX2C通路扰乱左右 patterning、通过HIF-1α/VEGF通路影响缺氧反应，以及干扰TFAP2介导的转录，导致OFT对位异常、分隔缺损与 laterality 异常。尽管Cited2 null小鼠呈现高外显率的TOF样缺损，但携带人类CHD患者CITED2丝氨酸-甘氨酸富集区T166N变异的突变小鼠未出现明显心脏异常，提示需要额外的遗传或环境修饰因子才能表现TOF表型。
3.4.5 Fog2?/?
Fog2（锌指蛋白多类型2，Zinc Finger Protein, Multitype 2）敲除小鼠是另一例特征明确的TOF样病理小鼠模型。Fog2通过与辅因子Gata4结合，驱动内皮细胞EndMT以促进垫形成及cNCC依赖的OFT分隔。Fog2?/?小鼠呈现一系列心脏畸形，包括极薄的心室心肌与共同房室通道（心内膜垫融合失败导致连续的ASD与VSD）。此外，在E13.5，Fog2?/?胚胎出现肺动脉下狭窄与OFT对位异常伴OA，部分复现了TOF的核心解剖特征。该模型的 caveat 在于，因心脏缺损，胚胎在E12.5-E14.5间死亡，故无法观察到通常出现于出生后TOF的右心室肥厚。与Fog2敲除小鼠表型一致，FOG2变异（如E30G与S657G）已被证实与人类TOF相关，但因变异阳性患者数量有限，无法建立详细的基因型-表型关联。综上，Fog2对正常心脏分隔至关重要，其缺失导致TOF样圆锥干缺损，但早期胚胎致死阻碍了完整TOF四联征的复现。
3.4.6 Tbx1neo2/neo
TBX1单倍剂量不足（最常见源于22q11.2染色体杂合微缺失）是包括TOF在内的人类圆锥干缺损的已确立病因。TBX1单倍剂量不足患者呈现主动脉弓缺损、VSD、TA与TOF等多种心脏畸形。小鼠中，Tbx1?/?纯合突变体显示严重心脏缺损（包括合并VSD的PTA），而Tbx1+/?杂合小鼠表型较轻，通常限于主动脉弓中断（IAA）与其他主动脉弓缺损，无法真实复现人类患者的表型变异。为弥补这一剂量差异，研究人员构建了仅表达20%正常Tbx1 mRNA的Tbx1neo2亚效模型。Tbx1Neo2/Neo突变小鼠确实呈现类似人类22q11.2综合征的心脏缺损，包括DORV、IAA、膜周部VSD及TA与TOF等OFT缺损。值得注意的是，小鼠需Tbx1表达降低80%才出现TOF样畸形，而人类患者仅需50%的降低（22q11.2缺失）即可导致TOF，且外显率可变。机制上，Tbx1缺失破坏多条OFT发育关键通路，包括影响咽弓cNCC迁移的Gbx2-Slit信号、FGF介导的祖细胞增殖及Wnt5a/PCP指导的细胞部署，导致OFT延长不足、心脏垫畸形与大动脉对位异常，这一系列发育扰动解释了TOF、DORV与动脉干等表型。综上，Tbx1Neo2小鼠模型复现了TOF样解剖，凸显了TBX1精细的基因剂量敏感性，但小鼠较人类需要更极端的Tbx1表达降低，凸显了物种差异仍是模拟人类圆锥干缺损的挑战。
3.4.7 Shh?/?
音猬因子（Sonic hedgehog, Shh）具有广泛的模式形成作用，延伸至心脏，是正常圆锥干发育所必需的。Shh?/?胚胎出现类似TOF合并肺动脉闭锁的严重圆锥干表型。所有检测的妊娠晚期突变体（E16.5–E18.5）均显示心血管发育异常，包括VSD、OA与心肌增厚（提示肥厚）。额外异常（包括共同心房、右位主动脉弓、房室瓣缩短与肺静脉异位回流）超出四联征范围，反映了更广泛的心脏发育破坏。围产期致死与严重的颅面及咽部缺损，阻碍了出生后右心室肥厚的评估。机制上，SHH信号在咽内胚层中是支持SHF增殖与cNCC存活所必需的。Shh缺失导致动脉极祖细胞耗竭，在更严重情况下，损害神经嵴细胞对流出道的贡献，破坏OFT延长与分隔。值得注意的是，即使存在室间隔，仍发生肺动脉闭锁，提示SHH祖细胞缺陷本身足以驱动这一表型。尽管Shh?/?小鼠的圆锥干表型与TOF合并肺动脉闭锁高度相似，但人类SHH突变最常见于非综合征型前脑无裂畸形，而非孤立性TOF。Hedgehog通路破坏可能更广泛地参与CHD，但SHH直接突变在孤立性TOF中的作用仍不明确。
3.4.8 Mef2cAHF?KO
转录因子MEF2C作用于前第二心场（anterior second heart field, AHF），是包括右袢与OFT对位在内的正常心脏形态发生所必需的，Mef2c缺失小鼠呈现早期胚胎致死。在小鼠AHF中条件性删除Mef2c（Mef2cAHF?KO）产生了一系列对位缺损，约半数突变体因发绀于出生后不久死亡。在36个检测的突变体中，5个呈现TOF样表型：主动脉骑跨、肺动脉狭窄或闭锁、膜周部VSD与右心室肥厚。由于Mef2cAHF?KO小鼠非胚胎致死，这是少数将右心室肥厚作为TOF样表型一部分（而非推断）记录的模型之一。其余突变体表现为孤立性瓣膜缺损、孤立性VSD、VSD合并DORV或VSD合并右型大动脉转位（d-TGA）。MEF2C通过AHF限制性增强子直接激活Tdgf1（编码Nodal共受体Cripto），其缺失时OFT中Tdgf1表达几乎完全消失。人类MEF2C相关疾病罕见，更常见特征为智力障碍、发育迟缓与运动障碍，先天性心脏病（包括TOF）虽有报道，但非主导临床特征。
3.4.9 Wnt信号通路
TOF的心脏畸形（尤其是圆锥干缺损）通常被认为源于SHF与心脏神经嵴细胞（NCCs）的形态发生紊乱。既往圆锥干心脏缺损分子机制研究表明，Wnt信号通路通过调控心脏祖细胞的增殖、分化与迁移影响心脏发育，尤其在调控OFT发育中起关键作用。多条Wnt信号通路（包括经典与非经典）组分的遗传扰动小鼠模型，均可复现类似TOF的圆锥干畸形，包括大动脉骑跨或错位、VSD与OFT异常。
3.4.9.1 Lrp6?/?
作为经典Wnt/β-catenin信号的重要共受体，Lrp6对该通路至关重要。多数Lrp6?/?小鼠可存活至出生，但出现显著心脏缺损。纯合胚胎从E11.5起出现严重圆锥干异常，进展为E14.5与E16.5的VSD、大动脉转位（TGA）与DORV，符合以主动脉显著骑跨为特征的严重圆锥干对位异常表型，而非经典TOF。Lrp6 KO突变体还显示咽弓中心脏神经嵴细胞（cNCCs）缺失。尽管未报道肺动脉狭窄，但cNCCs在OFT发育中的重要作用及OFT垫缺损与肺动脉缺损的相关性提示，OFT分隔失败参与了TOF相关圆锥干缺损的发育起源。
3.4.9.2 Ctnnb1Dermo1?Cre
由于β-连环蛋白（β-catenin）在原肠胚形成前的早期胚胎发生中至关重要，全局敲除或严重敲低Ctnnb1模型在 gastrulation 前即胚胎致死。在中胚层来源的咽间质中条件性缺失β-catenin（Ctnnb1flox/flox; Dermo1-Cre小鼠）导致严重圆锥干畸形：至E16.5，表现为肺动脉分支发育不全、主动脉弓异常、房间隔缺损（100%外显率）、室间隔缺损（100%外显率）、右室双出口（25%外显率）与主动脉骑跨（50%外显率），高度类似TOF的结构特征，但未报道右心室肥厚。相比之下，在第二SHF祖细胞中使用Ctnnb1flox/flox; Mef2c-Cre条件性删除β-catenin，则呈现更局限的表型：右心室（RV）体积减小、OFT缩短，伴E12.5时远端OFT肺动脉干与主动脉分隔失败。后者模型强调Wnt/β-catenin信号促进SHF扩张并抑制第一心场（FHF）发育。综上，SHF祖细胞内的Wnt/β-catenin信号主要贡献于RV与OFT发育，对远端OFT分隔尤为关键，但似乎非房间隔与室间隔分隔所必需。相反，中胚层来源咽间质中β-catenin缺失导致更广泛的缺损。这些发现与正常心脏发育中这些细胞群体的贡献一致，凸显了经典Wnt信号在心脏发生中的空间特异性作用。考虑到VSD是TOF中氧合血与脱氧血混合的关键病变，Ctnnb1flox/flox; Dermo1-Cre模型为TOF的早期胚胎分析提供了更合适的系统。
3.4.9.3 Wnt5a?/?
作为非经典Wnt信号通路的关键组分，Wnt5a的严格调控表达对正常OFT形态发生不可或缺。小鼠全局删除Wnt5a导致围产期致死，伴随严重心脏畸形，最显著者为圆锥干异常。几乎所有E13.5–E17.5检测的Wnt5a null胚胎均显示VSD合并PTA，约半数突变体还出现主动脉弓异常，包括主动脉弓中断（IAA）与右位主动脉弓（AoR）。仅少数胚胎呈现TGA或DORV。PTA与VSD的高外显率强烈提示Wnt5a缺陷扰乱了整个OFT发育程序，破坏了漏斗隔的近端分隔及其随后对室间隔的贡献。然而，在SHF祖细胞中过表达Wnt5a的E9.5小鼠中也观察到OFT缩短表型。WNT5A通过PCP通路调控SHF细胞极性：Wnt5a缺陷胚胎中，尾侧脏壁中胚层（SpM）无法向头侧贡献SHF细胞；而Wnt5a过表达则导致SHF细胞在SpM的膨出中积聚，从而复现OFT缩短与圆锥干缺损。后续通过PCP效应因子Daam1挽救Wnt5a缺陷表型进一步证实了这一机制。除在SHF中的作用外，Wnt5a在咽中胚层的表达也提示其与心脏神经嵴细胞（NCCs）的关联。尽管WNT5A不显著影响NCC迁移，但可能通过Wnt/Ca2+信号调控心脏NCC向动脉肺动脉间隔的凝聚。总体而言，Wnt5a?/?胚胎的表型与TOF常见的圆锥干异常重叠，尤其是VSD与OFT分隔缺损。鉴于TBX1是Wnt5a的上游转录激活因子，Tbx1突变胚胎中观察到的可比缺陷进一步强调了Wnt5a在协调圆锥干形态发生中的关键作用。
3.4.9.4 Wnt11?/?
作为另一种非经典Wnt配体，WNT11与WNT5A功能重叠但存在差异，同样通过PCP与Wnt/Ca2+通路协调心脏发生与圆锥干形态发生。Wnt11敲除小鼠呈现高外显率的胚胎致死，尤其在129S遗传背景下。尽管心脏环化正常，最早在E9.5即出现OFT缩短这一心脏缺陷。至E10.5，突变胚胎显示心室腔扩张、心室壁变薄及小梁排列不规则、发育不全。这些胚胎在E14.5出现OFT与背侧间充质突起（DMP）的完全外显率缺损，OFT旋转异常导致DORV与TGA伴VSD。谱系特异性删除进一步表明，在cTnT-Cre标记的心肌细胞与Isl1-Cre标记的SHF祖细胞中消融Wnt11，可复现种系null胚胎的心脏缺损；而在神经嵴、心内膜或心外膜谱系中删除则未产生可检测表型。这些发现表明，Wnt11?/?小鼠模拟了由SHF来源心肌群体驱动的严重OFT对位异常，代表了一种非神经嵴机制的圆锥干缺损形成模式。
3.4.9.5 Vangl2Lp/Lp
Vangl2是非经典Wnt信号通路的关键组分。携带Vangl2功能缺失等位基因的Looptail（Lp）突变体呈现相似的圆锥干畸形，包括E13.5的DORV与VSD。部分Vangl2Lp/Lp小鼠还存在心脏环化异常与主动脉弓异常，类似TOF患者常见的右位主动脉弓。E14.5时，Vangl2flox/flox; Sox2-Cre胚胎完全复现Vangl2Lp/Lp表型，包括严重颅脊柱裂、DORV、VSD与咽弓重塑缺损，与Vangl2Lp/Lp胚胎无法区分，证实VANG2缺失是这些畸形的原因。相反，Vangl2flox/flox; Wnt1-Cre胚胎未出现心脏或OFT异常，在E14.5与出生后表型正常。这些结果表明，Lp突变体中观察到的OFT缺损可能源于神经上皮而非cNCC谱系，提示在cNCCs中，Vangl2或非经典PCP通路对正常OFT形成可能并非必需。综上，经典与非经典Wnt信号通路对SHF、cNCCs及间质贡献于OFT分隔与室间隔形成均不可或缺。这些模型中的Wnt信号破坏一致导致严重圆锥干畸形，常复现TOF相关的关键结构特征。重要的是，谱系特异性模型表明，这些缺损通过不同机制产生，为解析TOF发病机制提供了互补框架。
3.5 纤毛相关寡基因小鼠模型
近期一项寡基因小鼠研究拓展了圆锥干心脏缺损的传统单基因框架，证明联合破坏多个纤毛相关基因可协同损害OFT发育。研究人员构建了6个靶向TOF患者测序数据鉴定出的纤毛相关候选基因的小鼠突变系，纯合子呈现围产期致死，伴随OFT与分隔缺损谱系，包括OA合并VSD与ASD。Pkhd1l1?/?纯合小鼠中此类缺损发生率最高。部分胚胎中合并的肺动脉狭窄进一步复现了TOF样特征。相比之下，携带单纤毛基因突变的杂合小鼠仅表现轻微且外显率不完全的心脏异常，与单个纤毛基因破坏对OFT形态发生的有限效应一致。然而，双杂合子交配导致圆锥干异常（尤其是OA）的发生率与严重程度显著增加。小鼠胚胎心脏转录组分析进一步发现，所有纤毛基因突变模型中Hedgehog信号一致下调，伴随下游心脏转录因子Gata4与Nkx2-5表达降低。这些发现共同凸显了纤毛功能作为圆锥干缺损发病机制的关键贡献者，并重要地表明，联合破坏多个纤毛基因比单基因突变提供了更强大且生物学相关的建模策略。这一寡基因框架进一步提示，对既往描述的单基因模型进行策略性杂交，可能更好地呈现人类TOF的遗传复杂
