重组人胸腺素β4通过抑制盐皮质激素受体信号改善实验性结肠炎和肠纤维化

《Molecular Biomedicine》：Recombinant human Thymosin β4 ameliorates experimental colitis and intestinal fibrosis through suppression of mineralocorticoid receptor signaling

　　

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）是一种慢性炎症性疾病，其特征为上皮屏障破坏、持续黏膜炎症和进行性肠纤维化，目前有效的治疗选择仍然有限。胸腺素β4（Thymosin β4, Tβ4）是一种高度保守的内源性肽，在组织修复和免疫调节中具有明确作用，但其对IBD发病机制的贡献尚未完全阐明。在此，研究人员发现编码Tβ4的基因TMSB4X在IBD患者的结肠组织中表达下调。为了探究其功能意义，研究人员构建了Tmsb4x基因缺陷小鼠，并证明内源性Tβ4的缺失显著增加了对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导结肠炎的易感性。相反，口服重组人Tβ4（recombinant human Tβ4, rhTβ4）在预防性和治疗性结肠炎模型中均显著改善了生存率，减轻了体重下降，减少了上皮损伤，并抑制了炎症细胞因子的产生。此外，rhTβ4减弱了肠纤维化，表现为纤维化相关标志物表达减少和胶原I沉积降低。转录组学分析揭示，rhTβ4部分恢复了DSS诱导的基因失调，并抑制了盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor, MR, NR3C2）信号，这一通路得到了报告基因实验和下游靶基因分析的进一步支持。总之，这些发现将Tβ4鉴定为一种针对肠道炎症和纤维化的内源性保护因子，并提示通过调节盐皮质激素受体信号来药理学恢复Tβ4活性可能代表一种有前景的IBD治疗策略。

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）是一种以克罗恩病（Crohn's disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）为主要亚型的慢性胃肠道炎症性疾病，其核心病理特征包括免疫应答失调、肠上皮屏障破坏及持续黏膜炎症，进而导致肠道稳态失衡。持续炎症可促进细胞外基质过度沉积和肠纤维化，引发管腔狭窄、狭窄形成甚至肠梗阻。目前临床治疗主要靶向炎症过程，但对已形成的纤维化疗效有限，患者常需内镜或手术干预。因此，鉴定能同时限制肠道炎症和纤维化重塑的内源性保护机制是IBD研究中未满足的重要需求。盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor, MR, NR3C2）是一种配体激活的核受体，传统上参与电解质和体液稳态，但异常MR信号被证实与心脏、肾脏等多器官纤维化相关，且其在肠道炎症和纤维化中的作用近年逐渐被认识。然而，调控MR激活的内源性机制尚不清楚。胸腺素β4（Thymosin β4, Tβ4）是由TMSB4X基因编码的43个氨基酸组成的保守肽，在组织修复、免疫调节、抗凋亡和伤口愈合中发挥多种功能。在胃肠道中，Tβ4由肠上皮和免疫细胞产生，参与黏膜稳态维持，但其在肠纤维化中的作用及对MR信号的影响尚未阐明。基于此，研究人员假设内源性Tβ4缺失会加重结肠炎易感性，而恢复Tβ4活性可通过调控MR信号减轻肠道炎症和纤维化。研究人员分析了人类IBD公共数据集，构建了Tmsb4x基因缺陷小鼠，在预防性和治疗性葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的结肠炎模型中评估重组人Tβ4（recombinant human Tβ4, rhTβ4）的效果，并进行转录组学和机制解析。研究证实Tβ4是迄今未被充分认识的肠道稳态调节因子，其药理学恢复通过抑制MR信号代表IBD的新治疗策略。该论文发表在《Molecular Biomedicine》。

关键技术方法方面，研究人员利用人类单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（来自scIBD数据库，整合GSE116222等8个公共数据集，共213个样本，涵盖UC、CD患者和健康对照的结肠、回肠等组织）分析TMSB4X表达；通过CRISPR/Cas9技术构建Tmsb4x基因敲除小鼠；建立DSS诱导的急性结肠炎模型（预防性：2% DSS 14天；治疗性：3.5% DSS 7天再恢复7天），口服给予rhTβ4；采用组织学染色（H&E、Masson三色、免疫组化）、转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析（GO富集、TRRUST转录因子分析）、细胞实验（小鼠结肠成纤维细胞MCFCs培养、醛固酮刺激、双荧光素酶报告基因）、qPCR和Western blot等。

研究结果按小标题概述如下：

**Reduced TMSB4X expression in colonic tissues from patients with IBD**：通过分析公共scRNA-seq数据集，发现TMSB4X在人类结肠多种细胞群中广泛表达，其中间充质细胞、上皮细胞、浆细胞和CD4⁺/CD8⁺ T细胞中阳性比例最高，而髓系细胞、T细胞、固有淋巴样细胞（ILCs）和内皮细胞中表达强度最高。与健康对照相比，UC和CD患者结肠组织（无论炎症或非炎症区域）中TMSB4X阳性细胞比例普遍降低，提示TMSB4X表达下调与IBD相关。

**Loss of Tβ4 increases susceptibility to DSS-induced experimental colitis model**：研究人员构建了Tmsb4x缺陷（Tβ4^-/-）小鼠，在基础状态下其结肠长度、组织学结构、上皮增殖活性（Ki67和BrdU标记）、杯状细胞标志物Muc2表达及促炎细胞因子水平均与野生型（WT）小鼠无显著差异，表明内源性Tβ4缺失不导致自发肠道炎症。经4% DSS处理5天后，Tβ4^-/-小鼠体重下降更严重、恢复更慢、死亡率更高，并出现更明显的结肠缩短、上皮破坏、肠壁水肿和管腔狭窄，同时结肠组织和血清中IL-1β、IL-6、TNF水平显著升高。口服rhTβ4（300 μg/天）可显著改善Tβ4^-/-小鼠的生存率和体重恢复，表明内源性Tβ4对DSS结肠炎具有保护作用。

**rhTβ4 treatment alleviates experimental colitis**：在预防性模型中，BALB/c小鼠接受2% DSS并每日口服rhTβ4（100或200 μg），100 μg剂量更有效地减轻体重下降、保护上皮结构、减少黏膜下水肿，并降低结肠组织促炎细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、CXCL1）水平。在治疗性模型中，小鼠先接受3.5% DSS诱导7天，随后口服rhTβ4（100 μg/天）7天，显著促进体重恢复、减少肠道出血、恢复结肠长度，并改善上皮完整性、隐窝结构和肠道水肿，同时抑制IFN-γ、TNF、IL-1β、IL-6、CXCL1等炎症因子。口服途径因在肠道内产生更高且更持久的暴露而优于腹腔注射。

**rhTβ4 treatment attenuates colonic transcriptomic alterations in experimental colitis**：对治疗性模型结肠组织进行RNA-seq，DSS处理导致2,431个差异表达基因（DEGs），其中1,491个上调、940个下调；而rhTβ4处理组仅1,353个DEGs（832上调、521下调）。主成分分析（PCA）显示DSS组与对照组分离，rhTβ4组向对照组偏移；层次聚类分析表明rhTβ4部分逆转DSS诱导的转录组变化。

**rhTβ4 suppresses fibrosis-associated transcriptional programs in experimental colitis**：GO富集分析显示，rhTβ4与DSS组间DEGs显著富集于细胞外基质（ECM）重塑和纤维化相关通路，如胶原含细胞外基质、ECM组织、糖胺聚糖结合等。rhTβ4处理逆转了DSS诱导的Mmp7、Mmp16、Col20a1、Reg3g等纤维化相关基因的上调，经qPCR验证。

**rhTβ4 attenuates intestinal fibrosis in experimental colitis**：Masson三色染色显示rhTβ4处理显著减少结肠胶原纤维沉积；免疫组化和Western blot分析一致证实rhTβ4降低胶原I和α-SMA蛋白表达，表明其抑制肠纤维化重塑。

**rhTβ4 suppresses mineralocorticoid receptor signaling and downstream profibrotic responses**：TRRUST转录因子富集分析发现MR（NR3C2）是rhTβ4与DSS组间DEGs最显著富集的转录因子。DSS处理后MR靶基因（Fkbp5、Sgk1、Tns2、Tsc22d3）表达上调，rhTβ4处理使其恢复至基础水平。在人类UC数据集（GSE87466和GSE75214）中，MR靶基因（SGK1、RASL12、FKBP5、TSC22D3）在结肠（而非回肠）中呈现上调趋势。体外实验中，醛固酮（MR激动剂）刺激小鼠结肠成纤维细胞（MCFCs）后，MR靶基因Fkbp5、Sgk1、Tns2表达上调，共处理rhTβ4可显著抑制该效应；双荧光素酶报告基因实验证实rhTβ4抑制醛固酮诱导的MR转录活性；同时，rhTβ4逆转了醛固酮引起的纤维化标志物Col1a和Acta2（编码α-SMA）的上调。

在讨论部分，研究人员总结Tβ4作为内源性保护因子，其缺失增加结肠炎易感性，而rhTβ4通过抑制MR信号发挥抗炎和抗纤维化作用。当前IBD治疗对纤维化效果有限，而rhTβ4具有显著抗纤维化活性，且安全性良好（基于临床前和早期临床研究），支持其临床转化潜力。研究首次将Tβ4与MR调控联系起来，并发现rhTβ4的非线性剂量反应（100 μg优于200 μg）可能反映双相效应。此外，rhTβ4降低IL-4和IL-10水平，提示其免疫调节而非单纯抑制炎症的特性。研究局限性包括：人类数据基于公共数据集、全身性敲除模型无法区分细胞类型特异性贡献、DSS模型不能完全模拟慢性纤维狭窄性病理、需进一步明确上游调控机制及与TGF-β等通路的相互作用。

研究结论部分翻译如下：总之，Tβ4作为内源性保护因子在肠道炎症和纤维化中发挥作用。rhTβ4改善了实验性结肠炎，减轻了纤维化重塑，并抑制了NR3C2信号。这些发现为Tβ4在IBD中的作用提供了机制见解，并支持Tβ4–NR3C2轴作为肠道炎症和纤维化的潜在治疗靶点。