综述：基于单细胞多组学技术的鹿茸研究进展

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Advances in deer antler research based on single-cell multi-omics approaches

　　

鹿茸是哺乳动物中唯一具备完全周期性再生能力且生长速率极快的附肢，为器官再生、组织生长及再生医学研究提供了独特模型。近年来，单细胞与空间多组学技术的革新显著深化了研究人员对鹿茸完全再生及快速生长过程中细胞与分子机制的理解。本综述整合转录组学、表观基因组学与空间图谱技术的相关进展，系统梳理了鹿茸干细胞/祖细胞群鉴定、调控程序解析、骨软骨分化轨迹追踪及支持快速组织扩张的血管重塑机制，并进一步讨论了跨物种比较研究的相关发现。最后，研究人员概述了当前领域面临的挑战与未来研究方向。上述进展为理解哺乳动物附肢再生及快速组织生长的机制提供了重要依据，也为再生医学与组织工程领域提供了潜在的策略参考。

引言

鹿茸是鹿科动物（驯鹿除外）雄性第二性征，作为哺乳动物中唯一可完全周期性再生的附肢，为再生医学研究提供了极具价值的模型。鹿茸的再生过程由鹿茸干细胞（AnSCs）调控，该类细胞既表达经典间充质干细胞标志物，也表达部分胚胎干细胞标志物，具备极强的增殖与分化潜能。体外研究显示，AnSCs可连续传代超过55代而不发生衰老，能够向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多谱系间充质细胞分化，证实其具备间充质多向分化潜能，但其是否具备超越间充质衍生物的其他谱系分化能力仍需进一步验证。AnSCs最初定位于鹿额嵴区域的生茸骨膜（AP），青春期时雄激素信号激活驻留的AnSCs启动生茸过程，形成鹿茸基座并发育出首对鹿茸（即鹿茸发生过程），随后进入年度完全再生周期。移植研究进一步证实AP具备完整的器官发生潜能，将其移植至裸鼠或鹿体内可诱导异位或种间鹿茸形成。鹿茸再生依赖于基座骨膜（PP），其细胞直接来源于AP，PP细胞可维持周期性鹿茸再生能力，并进一步分化为鹿茸生长中心（AGC）——这一特殊结构驱动鹿茸以每日最高2 cm的速率生长，3-4个月内可形成数十公斤组织且不形成肿瘤。既往鹿茸研究主要依赖形态学与组织学方法，后续AnSCs的发现与表征确立了AP的固有器官发生能力，但鹿茸再生与快速生长背后的细胞异质性、谱系关系及调控机制仍未得到充分解析。近年来，单细胞与空间多组学技术的发展推动鹿茸形成的研究范式从“组织自主过程”向“动态多细胞再生生态系统”转变，相关研究通过解析细胞身份、发育轨迹、基因调控网络及空间组织结构，揭示鹿茸发生、再生与快速生长并非仅由干细胞/祖细胞驱动，而是依赖干细胞/祖细胞、软骨细胞、血管细胞、免疫细胞等多细胞群落的协同互作，为理解哺乳动物附肢再生的细胞互作、分子通路及组织微环境调控机制提供了新视角。

单细胞鹿茸图谱

早期研究首次构建了激活态与休眠态AP、PP及相邻非再生面部骨膜的单细胞图谱，鉴定出包括THY1⁺ AnSCs、TNN⁺TNC⁺DLX5⁺SOX9⁺RUNX2⁺祖细胞、成骨软骨细胞、血管周细胞、内皮细胞及免疫细胞在内的多样细胞群，建立了首个鹿茸发生与再生的全面细胞图谱，为后续解析相关细胞互作与调控网络的机制研究奠定了基础。后续针对鹿茸再生多阶段的单细胞分析进一步完善了该框架：研究发现PRRX1⁺ AnSCs是鹿茸再生极早期激活的主要间充质干细胞群，其转录轨迹符合向TNN⁺TNC⁺DLX5⁺鹿茸芽基祖细胞（ABPCs）分化的特征，而ABPCs是再生芽基中的主要祖细胞群，这一发现支持“特化间充质干细胞/祖细胞群是鹿茸再生的关键细胞储备”的观点。但受限于目前缺乏明确的遗传谱系追踪技术与基因工程鹿模型，多数谱系关系仅通过转录组相似性与计算轨迹分析推断，鹿茸干细胞/祖细胞的发育潜能与谱系边界仍需进一步功能验证。近期空间转录组学研究全面解析了快速生长期AGC的细胞组成与空间架构，在 distinct 空间有序组织层中鉴定出软骨细胞、肥大软骨细胞、中间态PHEX⁺细胞、成骨细胞及破骨细胞等晚期发育细胞群，空间分析进一步揭示出高度有序的远端-近端发育轴，凸显了快速生长期多组织区室协同扩张、成熟与分化的特征。

调控THY1⁺PRRX1⁺RXFP2⁺ AnSCs的 signaling 通路在鹿茸发生中的作用

研究人员通过对AP、面部骨膜及长骨骨膜等骨膜组织的比较单细胞转录组分析，鉴定出一类独特的鹿茸干细胞亚群——THY1⁺PRRX1⁺RXFP2⁺ AnSCs，该亚群在雌雄鹿的AP中均特异性富集。现有单细胞转录组研究支持如下模型：THY1⁺PRRX1⁺RXFP2⁺ AnSCs是产生TNN⁺TNC⁺DLX5⁺SOX9⁺RUNX2⁺鹿茸祖细胞的关键亚群，后者进一步向软骨谱系分化。现有证据提示多条 signaling 通路参与THY1⁺PRRX1⁺RXFP2⁺ AnSCs的激活与分化：体外研究显示雄激素处理可上调RXFP2表达，而青春期相关雄激素信号参与鹿茸发生，提示AR-RXFP2调控轴可能在鹿茸早期发生中发挥作用；另有独立证据提示经典Wnt signaling 的参与，Wnt共受体LRP6表达升高，且LRP6敲除后成骨分化受损，提示LRP6介导的Wnt signaling 参与THY1⁺PRRX1⁺RXFP2⁺ AnSCs的激活与分化。目前尚不清楚AR-RXFP2与Wnt signaling 是协同还是独立发挥作用，其精确功能仍需体内功能实验进一步验证。

鹿茸发生的免疫调控

累积证据凸显免疫调控在鹿茸发生中的关键作用。雄性AP中AnSCs分泌的IL-34可促进M2型巨噬细胞招募，在免疫缺陷小鼠异种鹿茸形成实验中，抑制M2巨噬细胞浸润会显著降低鹿茸形成效率，提示免疫-干细胞互作对鹿茸发生具有重要支持作用；一致地，局部给予巨噬细胞来源因子足以诱导雌性鹿发生鹿茸，进一步支持巨噬细胞相关信号参与鹿茸发生的激活过程。针对驯鹿鹿茸相关皮肤（鹿茸茸皮）的单细胞转录组分析揭示了与无瘢痕再生相关的特化免疫微环境：与背侧皮肤相比，茸皮成纤维细胞呈现胎儿样转录特征与免疫调节特性，可限制过度炎症反应，促进再生而非纤维化结局。上述研究发现推动了对鹿茸发生的认知从传统的“干细胞/祖细胞中心论”向“多细胞生态系统论”转变，免疫细胞在干细胞微生态中扮演主动调控者而非被动参与者的角色，但免疫来源信号调控AnSC激活、自我更新及谱系决定的分子机制仍不明确。

鹿茸快速生长的基因调控程序

染色质可及性与转录组的整合分析揭示了与鹿茸快速生长相关的特化调控程序：增殖性鹿茸祖细胞中TP53 signaling 与凋亡相关通路基因的表达与染色质可及性显著增强，而骨肉瘤细胞则优先激活DNA修复与MYC驱动的转录程序，提示鹿茸快速生长并非仅由增殖活性增强驱动，而是依赖细胞周期进程、应激反应与基因组稳定性维持的协同调控。值得注意的是，增殖性鹿茸祖细胞中的MYC靶基因与骨肉瘤细胞中的MYC靶基因存在显著差异，提示鹿茸生长采用独特的转录程序，在实现强效增殖的同时严格调控细胞命运与细胞稳态。与MYC激活常伴随失控性生长与基因组不稳定的恶性增殖不同，增殖性鹿茸祖细胞似乎采用调控机制平衡增殖能力与组织有序性。上述发现凸显了整合染色质可及性与转录组信息以鉴定快速生长特异性基因调控网络的重要性，但MYC如何与其他转录因子及表观遗传调控因子协同调控鹿茸快速生长仍需实验验证。

PHEX⁺中间细胞群与鹿茸快速生长中的杂交骨化

空间转录组学鉴定出一类定位于肥大软骨细胞与成骨细胞之间的PHEX⁺细胞群，伪时间分析提示肥大软骨细胞可通过PHEX⁺中间态向成骨样细胞连续转变；此外，异种移植实验为体内肥大软骨细胞来源细胞向成骨群落的贡献提供了支持证据，上述发现提示细胞命运转变参与鹿茸骨化过程。基于此，研究人员提出“杂交骨化”模型，即肥大软骨细胞相关的成骨转变可能共同参与鹿茸快速生长期的骨形成。该模型目前得到空间转录组学与移植研究的支持，但尚未通过直接谱系追踪实验验证，其与哺乳动物骨骼发育中“肥大软骨细胞可参与内软骨骨化过程中的成骨细胞形成”的累积证据一致。不过，PHEX⁺中间群落的身份及快速生长期软骨细胞向成骨细胞转化的程度仍待解析，受限于遗传谱系追踪系统与转基因鹿模型的缺失，目前仍缺乏谱系转化的直接证据。未来需整合谱系追踪策略的研究，以明确PHEX⁺细胞是真正的成骨中间体，还是广泛分化连续体中的瞬时转录状态。

鹿茸快速生长期的血管化软骨与血管生成微环境形成

与典型哺乳动物生长软骨不同，AGC包含高度血管化的软骨结构，与极速组织扩张密切相关。单细胞与空间转录组的整合分析揭示了AGC远端-近端轴血管组织的显著空间异质性：近端区域呈现缺氧与血管生成特征，HIF1A与VEGFA表达升高；远端区域则富集血管成熟相关基因，包括PDGFB与ANGPT1。细胞间通讯分析进一步揭示，AGC远端区域通过PTN-SDC1、MDK-SDC1、WNT5A-FZD、VEGFA-KDR等多条血管生成通路与血管细胞互作，提示协同血管重塑可能支持鹿茸快速生长。针对血管微环境独特性的进一步证据来自异种移植研究：将AP组织移植至免疫缺陷小鼠后可形成嵌合血管系统，其中内皮细胞主要来源于宿主，而血管周细胞与移植物来源的祖细胞群相关，提示祖细胞与宿主血管在血管微环境形成过程中存在协同互作。新形成的血管网络可通过提供氧气、营养物质及血管生成信号进一步支持鹿茸快速生长，因此鹿茸干细胞/祖细胞与血管细胞可能形成双向调控网络，血管重塑支持AGC内祖细胞活性与骨软骨再生。

跨物种比较

针对再生与非再生系统的比较单细胞分析为理解形态发生再生的保守与分化细胞程序提供了重要视角。鹿茸再生早期（脱落后第5天）出现的ABPCs群表达PTN、TNC、TNN、DLX5等软骨发生与肢发育相关基因，该转录程序在再生性小鼠趾尖（P3）组织中同样存在，但在非再生性P2组织中基本缺失。尽管这些哺乳动物发育程序与其他再生系统（包括蝾螈肢再生、斑马鱼鳍再生）的重叠有限，但其分子与功能保守程度仍不明确。上述观察提示哺乳动物形态发生再生可能依赖发育与再生程序的选择性重激活，而非通用再生特异性细胞类型或转录模块的部署。需注意的是，上述发现不应被解读为芽基细胞是普遍多能的再生细胞，累积证据显示芽基是异质性动态结构，由谱系偏向性祖细胞、过渡细胞状态及微环境支持群组成，因此鹿茸芽基形成更可能反映特化细胞生态系统中发育与再生程序的协同重激活，而非完全逆转为多能胚胎状态。此外，鹿茸干细胞/祖细胞的发育起源是跨物种比较的另一重要维度：神经嵴来源的间充质细胞是脊椎动物发育中一类高度多能且具迁移特性的细胞谱系，参与包括软骨、骨在内的多种颅面结构形成；牙髓间充质干细胞与鹿茸干细胞/祖细胞均被推测部分起源于颅神经嵴来源谱系，近期单细胞转录组研究进一步提示上述细胞群存在转录相似性，暗示颅面间充质可塑性存在共享调控程序，但该相似性究竟反映保守发育起源，还是与再生能力相关的趋同转录状态，仍需进一步研究明确。

展望与未来方向

本综述系统梳理了单细胞多组学技术在解析鹿茸发生、再生与快速生长的细胞与分子机制中的应用，相关研究显著推进了研究人员对干细胞/祖细胞异质性、谱系特化、血管微环境形成及细胞间通讯的理解，但功能验证（尤其是体内外谱系追踪与遗传扰动）仍是确认候选调控因子与推断发育关系的核心。尽管取得上述进展，多个基础生物学问题仍待解决：其一，AnSCs的异质性与发育起源。尽管单细胞分析已鉴定出再生鹿茸中的多类干细胞/祖细胞群，但其发育起源及连续鹿茸周期中的谱系关系仍未完全解析，尤其是颅神经嵴来源祖细胞是否直接参与鹿茸发生与再生仍无定论，未来需整合空间多组学与体内谱系追踪（包括遗传命运图谱与CRISPR-based谱系记录）技术，以重构发育层级并解析AnSC群在原位组织中的空间动态。其二，调控鹿茸发育的基因调控网络。近期单细胞研究已鉴定出AR-RXFP2、Wnt、血管生成、免疫相关等多条参与鹿茸发生的 signaling 通路，但这些通路如何整合为动态基因调控网络（GRNs）以协调干细胞激活、谱系决定与组织重塑仍不明确，未来需结合单细胞转录组、染色质可及性分析与扰动策略，重构情境特异性GRNs并鉴定调控细胞命运的关键转录因子，通过整合计算网络推断与功能验证，从系统层面理解鹿茸形成的启动与维持机制。其三，成骨转分化的机制。PHEX⁺中间细胞群的鉴定提示存在连接肥大软骨细胞与成骨细胞的杂交骨化通路，但该细胞群是否为稳定中间体仍待明确，未来研究需超越轨迹推断，通过谱系追踪结合可重现骨软骨转变的体外或3D软骨-骨类器官模型进行直接功能验证，结合时间分辨单细胞多组学与活细胞成像，动态表征杂交骨化过程中的细胞类型转变。其四，再生性血管与免疫微环境的组装。鹿茸快速生长依赖由内皮细胞、血管周细胞、基质细胞、免疫细胞及干细胞/祖细胞组成的特化微环境的协同建立，尽管近期研究已开始解析血管发育相关的细胞互作，但血管重塑与免疫调控、干细胞激活的协调机制仍不清楚，未来需整合空间转录组、谱系追踪与血管类器官或微流控“鹿茸芯片”系统，从机制层面解析各细胞区室如何协同支持快速生长。其五，支持快速生长的代谢重编程。鹿茸的极高生长速率需要广泛的代谢适应以维持快速增殖、软骨发生、血管生成与骨化，但相关代谢程序仍未被充分探索，未来需整合空间代谢组、单细胞代谢分析与稳定同位素示踪技术，结合转录组数据解析不同生长微环境中的代谢通量，明确代谢网络如何在维持极速非肿瘤性生长的同时，协调干细胞/祖细胞激活、谱系转变与矿化过程。其六，跨物种再生框架与转化应用。作为唯一具备完全形态发生再生能力的哺乳动物器官，鹿茸为再生生物学与转化医学提供了独特模型，未来需优先建立标准化的多组学参考图谱与统一注释流程，以实现与趾尖、颅面组织、牙髓、骨骼修复模型等其他再生系统的系统比较，通过整合上述比较数据集与干细胞、类器官平台，推动鹿茸来源再生原理向生物材料设计、组织工程与再生医学的转化应用。