TurboFlow在线净化结合同位素标记内标-液相色谱-串联质谱法快速测定茶叶中三种糖类

《Journal of Food Composition and Analysis》：Rapid determination of three sugars in tea by TurboFlow online purification and isotope-labeled internal standard- liquid chromatography-tandem mass spectrometry

　　

建立了一种基于TurboFlow在线净化和同位素标记内标-液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时检测茶叶中三种糖（蔗糖、果糖、葡萄糖）的分析方法。研究人员采用水提取茶叶样品，经TurboFlow在线净化，利用LC-MS/MS分析，并使用同位素标记内标法定量。平均回收率范围为76.0%至106.5%。果糖、葡萄糖和蔗糖的定量限分别为1.0、5.0和5.0 mg/kg。相对标准偏差范围为3.5%至9.7%。本研究建立的TurboFlow在线净化方法具有前处理简单高效、灵敏度高的特点，能够实现对茶叶中蔗糖、果糖和葡萄糖的精确定性和定量测定。它为茶叶质量的客观评价提供了可靠的技术支持，并适用于茶叶中糖含量的定量测定。

### 论文解读：TurboFlow在线净化结合同位素标记内标-液相色谱-串联质谱法快速测定茶叶中三种糖类

#### 研究背景与问题
茶叶是全球重要的经济作物，中国作为传统产茶和贸易大国，2025年1月至10月出口量达34.31万吨，同比增长12.40%。茶叶质量与安全一直是关注焦点，其中风味品质是核心研究内容之一。茶叶中的可溶性糖（主要为蔗糖、果糖和葡萄糖）是茶汤甜味的主要贡献者，影响不同茶类与等级的感官特征。然而，在加工过程中，不法商家可能通过添加廉价糖类（如蔗糖）来改善外观、提升口感并增加重量，以次充好。中国标准规定茶叶不得含有任何添加剂，人工加糖扰乱市场秩序，且加糖茶易吸潮、变质并滋生微生物，带来安全风险。过量糖摄入还可能导致肥胖、糖尿病等健康问题。此外，糖类组成与茶树品种、生长环境及加工工艺密切相关，可作为产地溯源的潜在指标。因此，建立一种灵敏、稳健且可靠的分析方法，用于茶叶中三种主要糖类的快速准确测定，对茶叶质量评估、等级划分和溯源分析具有重要理论和实践意义。

现有方法包括液相色谱-蒸发光散射检测（LC-ELSD）、离子色谱、气相色谱（GC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等。LC-ELSD平衡时间长，易受茶基质（如多酚、氨基酸）干扰；离子色谱峰宽、分辨率差；GC需衍生化，步骤繁琐；而LC-MS/MS虽性能优异，但多数研究仅采用水提取后直接分析，缺乏净化步骤，导致基质干扰严重，缩短色谱柱寿命。离线固相萃取（SPE）可有效净化，但操作复杂、成本高且基质效应强。为克服这些问题，研究人员引入TurboFlow在线净化技术，该技术基于湍流色谱柱，通过分子扩散、尺寸排阻和化学保留机制，实现自动化在线样品前处理，大幅缩短时间并提高通量。结合同位素标记内标法，可校正提取效率、净化损失和基质效应，提高定量准确性。该论文发表在《Journal of Food Composition and Analysis》。

#### 主要技术方法
研究人员采用TurboFlow在线净化技术结合同位素标记内标（蔗糖-¹³C₆、果糖-¹³C₆、葡萄糖-¹³C₆），通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析。样本来源为市场购买的52批茶叶样品（25种绿茶、20种红茶、7种普洱茶）。关键技术包括：水提取结合超声辅助萃取；使用C18柱（2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm）作为TurboFlow在线净化柱，以高水相（98%水+2%乙腈）为载样洗脱液；采用NH₂柱（4.6 mm × 150 mm, 3.0 μm）作为分析柱进行色谱分离；电喷雾离子源（ESI）负离子模式，多反应监测（MRM）检测；同位素内标法校正基质效应。

#### 研究结果
**3.1 MS/MS条件优化**
通过流动注射进样，比较正负离子模式，发现负离子模式响应值显著更高，故选择[M?H]^?分子离子峰。优化碰撞能量，获得稳定且高信号的碎片离子作为定量和定性离子对。确立了蔗糖、果糖、葡萄糖及其同位素内标的MRM离子对及碰撞能量参数。

**3.2 LC条件优化**
对比NH₂柱和HILIC柱对三种糖的分离效果。HILIC柱难以分离果糖和葡萄糖，而NH₂柱在乙腈-水流动相体系下实现了果糖和葡萄糖的良好分离，分离效率优越。

**3.3 样品前处理条件优化**
比较超声辅助萃取与振荡萃取，超声提取回收率（91.3%）高于振荡（84.5%），故选用超声辅助。比较纯水、25%乙醇和50%乙醇作为提取溶剂，纯水回收率最高（93.6%），因此选择纯水为提取溶剂。

**3.4 净化条件优化**
评估两种C18柱（商用在线净化柱0.5 mm × 50 mm, 60 μm与常规分析柱2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm）的净化效果。常规C18分析柱显著降低基线背景，去除更多杂质峰，净化性能更优。采用高水相溶液（98%水+2%乙腈）上样和洗脱，减少有机溶剂消耗。通过监测净化柱流出液，确定目标糖在3.00–5.33 min内洗脱，随后用高有机相溶液清洗柱子。

**3.5 基质效应**
比较直接进样与在线净化后的基质效应（ME），在线净化显著降低了基质效应。为进一步提高准确性，添加同位素内标校正离子抑制和基质干扰。

**3.6 线性与定量限**
在0.10–5.0 μg/mL浓度范围内，三种糖线性良好，相关系数均>0.999。以信噪比≥10确定定量限（LOQ）：果糖1.0 mg/kg，葡萄糖和蔗糖各5.0 mg/kg。展示了LOQ浓度下的加标样品MRM色谱图。

**3.7 精密度与准确度**
在空白茶叶样品中进行三个浓度水平的加标回收实验（n=6），平均回收率76.0%–106.5%，相对标准偏差（RSD）3.5%–9.7%，符合欧盟标准（70%–120%）。中间精密度实验（连续三天，每天5次平行）回收率78.3%–93.2%，RSD<6.2%，表明方法准确度和重现性好。

**3.8 与已报道方法比较**
与文献方法比较定量限，本方法部分值低于部分文献，部分值略高，但主要优势在于TurboFlow在线净化实现了样品净化与色谱分析的在线耦合，避免离线SPE的繁琐步骤，分析效率提高3–5倍，减少人为误差和交叉污染风险，适合大批量样品筛查。相比GC法，无需衍生化，简化操作且避免衍生化损失。

**3.9 实际样品应用**
检测21个绿茶、26个红茶和5个普洱茶样品中三种糖含量。蔗糖含量范围0.0398–21.6 g/kg，果糖0.0973–23.9 g/kg，葡萄糖0.136–20.4 g/kg。绿茶中蔗糖含量显著高于红茶和普洱茶，而红茶中果糖和葡萄糖含量普遍高于绿茶。

#### 总结讨论与结论
讨论部分指出，TurboFlow在线净化结合同位素内标有效克服了传统离线前处理耗时、基质干扰强的问题。尽管残留基质效应无法完全消除，但同位素内标可补偿离子抑制，保证定量准确性。高水相流动相减少有机溶剂消耗，符合绿色分析化学要求。方法操作简单、自动化程度高、结果可靠，适用于多种茶叶基质中糖类的高通量检测，为茶叶质量评价和成分分析提供了技术支持。

**结论翻译**：本研究开发了一种结合TurboFlow在线净化与同位素标记内标-液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的快速分析策略，用于同时定量茶叶样品中的蔗糖、果糖和葡萄糖。传统离线糖类前处理耗时且易受复杂茶基质干扰。TurboFlow系统实现自动化在线净化，简化样品前处理。尽管无法完全消除弱残留基质效应，但同位素标记内标有效补偿了离子抑制，确保定量准确性。由于使用高水相流动相，该方法减少了有机溶剂消耗，满足绿色分析化学要求。该方法操作简便、自动化程度高、准确可靠，可应用于多种茶基质中糖类的高通量检测，为茶叶质量评价和成分分析提供了有用的技术支持。