《Journal of Food Composition and Analysis》：The co-fermentation effect on wine by S. cerevisiae and three Hanseniaspora species selected based on the genotype and β-glucosidase activity
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区域性非酿酒酵母菌株因其对葡萄酒品质的影响而受到更多关注。本研究聚焦于中国贵州的本土汉逊酵母（Hanseniaspora）菌种。首先，研究人员鉴定了284株葡萄汁汉逊酵母（H. uvarum）、117株仙人掌汉逊酵母（H. opuntiae）和8株西方汉逊酵母
区域性非酿酒酵母菌株因其对葡萄酒品质的影响而受到更多关注。本研究聚焦于中国贵州的本土汉逊酵母（Hanseniaspora）菌种。首先，研究人员鉴定了284株葡萄汁汉逊酵母（H. uvarum）、117株仙人掌汉逊酵母（H. opuntiae）和8株西方汉逊酵母（H. occidentalis）分离株，并通过微卫星（microsatellite）分析将其划分为11种基因型。其次，研究人员设计了一套方案，在熊果苷（arbutin）培养基、YPD肉汤和模拟培养基上观察单菌株的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性，以及与酿酒酵母（S. cerevisiae）的非接触共培养，以筛选候选分离株和接种方式。第三，与纯酿酒酵母（S. cerevisiae）发酵相比，在赤霞珠（Cabernet Sauvignon）的顺序发酵（sequential fermentation）中，β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性增强，同时相对总酯和酮类含量增加近一倍。发酵组与相对气味活度值（rOAV）≥1的挥发性化合物之间存在强相关性，包括ZUS组（先接种H. uvarum FBKL2.9680，48小时后接种S. cerevisiae FBKL2.9126）与癸酸甲酯和乙酸异戊酯，ZPS组（H. opuntiae FBKL2.9515顺序发酵）与苯乙醛和辛酸乙酯，以及ZCS组（H. occidentalis FBKL2.9H25顺序发酵）与丁酸乙酯和β-大马士酮（β-damascenone）。本研究强调了候选筛选方案以及具有高β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性的H. uvarum、H. opuntiae和H. occidentalis在葡萄酒酿造中的应用潜力。
**研究背景与问题**
在葡萄酒酿造中，葡萄浆果表面的微生物群落，尤其是酵母菌，对葡萄酒感官特性具有关键作用。汉逊酵母（Hanseniaspora）是成熟葡萄上的主要非酿酒酵母（non-Saccharomyces）属之一，在酒精发酵初期可占酵母种群的75%，并能通过β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）等酶类释放结合态香气物质，提升葡萄酒的香气复杂性。然而，与酿酒酵母（S. cerevisiae）及其他商业化的非酿酒酵母（如Torulaspora delbrueckii等）相比，汉逊酵母的商业化应用较少，主要原因在于其早期培养能力丧失带来的接种比例和时序要求较高。此外，现有研究多集中于常见种（如葡萄汁汉逊酵母H. uvarum和仙人掌汉逊酵母H. opuntiae），而对罕见种（如西方汉逊酵母H. occidentalis）的酶活性及发酵潜力报道较少。同时，不同培养基条件（如熊果苷（arbutin）培养基、YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）肉汤）对β-葡萄糖苷酶活性测定结果的影响，阻碍了大规模筛选高活性菌株的比较分析。因此，本研究旨在基于基因型分析和β-葡萄糖苷酶活性，系统筛选贵州本土汉逊酵母候选菌株，并评估其在葡萄酒酿造中的共发酵效果。
**研究内容与意义**
研究人员从中国贵州省紫云县、三都水族自治县和息烽县的葡萄自然发酵样品中分离出409株汉逊酵母，通过分子鉴定（5.8S-ITS-RFLP（Internal Transcribed Spacer Restriction Fragment Length Polymorphism）和26S rRNA D1/D2域测序）确认其物种归属，并利用微卫星（microsatellite）分析进行基因分型。随后，在熊果苷培养基、YPD肉汤和模拟培养基中定性和定量测定β-葡萄糖苷酶活性，并通过单菌株模拟发酵和非接触共培养发酵（使用合成葡萄汁）筛选高活性菌株。最终，在赤霞珠（Cabernet Sauvignon）葡萄汁中进行顺序发酵，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC/MS）分析挥发性化合物，结合相对气味活度值（rOAV）和主成分分析（PCA）揭示共发酵对香气的影响。该研究为汉逊酵母在葡萄酒酿造中的候选菌株筛选和应用提供了重要理论依据，论文发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。
**主要关键技术方法**
本研究采用的关键技术方法包括：微卫星（microsatellite）分析进行基因分型（针对H. uvarum、H. opuntiae和H. occidentalis分别设计引物）；β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性定性（熊果苷培养基上棕色晕圈直径/菌落直径比）和定量（以p-NPG（4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷）为底物，测定p-NP（对硝基苯酚）生成量）方法；单菌株模拟发酵（含葡萄糖、果糖等的模拟培养基）；非接触共培养发酵（使用合成葡萄汁，通过0.22 μm膜分隔汉逊酵母和酿酒酵母）；赤霞珠葡萄汁顺序发酵（先接种汉逊酵母，48小时后接种酿酒酵母，样本来自河北省怀来县）。挥发性化合物分析采用HS-SPME-GC/MS（顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用），rOAV计算和PCA（主成分分析）用于解析香气特征。
**研究结果**
**分子鉴定与遗传多样性分析**
通过5.8S-ITS-RFLP和D1/D2序列分析，409株汉逊酵母被鉴定为3个种：284株H. uvarum、117株H. opuntiae和8株H. occidentalis。微卫星分析进一步划分出11种基因型，包括H. uvarum的3种（UV1、UV2、UV3），H. opuntiae的4种（OP1-OP4），以及H. occidentalis的4种（OC1-OC4）。基因型分布与分离来源（葡萄品种、采收月份和地点）密切相关，例如紫云县的刺葡萄（Vitis davidii）样品中H. opuntiae基因型丰富，而三都县的水晶葡萄是H. occidentalis的唯一来源。
**β-葡萄糖苷酶活性的定性与定量分析**
在熊果苷培养基上，409株菌中有181株显示高活性，219株中等活性，9株无活性。定量测定182株菌的β-葡萄糖苷酶活性（YPD肉汤中），81%的H. uvarum、68.9%的H. opuntiae和所有H. occidentalis具有酶活性。H. uvarum FBKL2.9H28（基因型UV3）总活性最高（1.22 U/mL），其次为H. opuntiae FBKL2.9252（1.20 U/mL）。不同基因型中，UV3（94%）和OP1（81%）的活性菌株比例最高，而OP4（52%）和UV2（62.5%）最低。值得注意的是，部分菌株在熊果苷培养基和YPD肉汤中表现不一致，如H. opuntiae FBKL2.9H148在熊果苷上无活性，但在YPD中显示中等活性（0.40 U/mL），表明酶活性受培养基影响显著。
**单菌株模拟发酵**
基于基因型和酶活性高低，筛选出6株菌进行单菌株模拟发酵（含100 g/L葡萄糖和100 g/L果糖）。所有汉逊酵母均无法独立完成发酵，残糖含量在10天后仍为150-170 g/L。β-葡萄糖苷酶活性主要集中在发酵初期（第1天），其中H. occidentalis FBKL2.9H25（基因型OC1）总活性最高（5.49 U/mL）。结合活性表现，选出H. uvarum FBKL2.9680、H. opuntiae FBKL2.9515和H. occidentalis FBKL2.9H25进行后续实验。
**非接触共培养发酵**
在合成葡萄汁中，非接触共培养系统（汉逊酵母与酿酒酵母通过0.22 μm膜分隔）显示，汉逊酵母培养种群在第3天后下降，而酿酒酵母保持高水平。β-葡萄糖苷酶活性主要在第8天出现高峰，其中H. uvarum FBKL2.9680与酿酒酵母共培养的总活性最高（2.6 U/mL）。
**赤霞珠葡萄汁顺序发酵**
在赤霞珠葡萄汁中进行顺序发酵（ZUS组：H. uvarum FBKL2.9680先接种；ZPS组：H. opuntiae FBKL2.9515；ZCS组：H. occidentalis FBKL2.9H25；对照ZS组：纯酿酒酵母发酵）。所有顺序发酵组在11天内完成发酵，乙醇含量约12%（vol），ZUS组总β-葡萄糖苷酶活性最高（40.2 U/mL），且活性主要出现在发酵中后期（第9天）。
**挥发性化合物分析**
共鉴定出77种挥发性化合物，包括高级醇、酸、酯、萜烯等。顺序发酵组（ZUS、ZPS、ZCS）的总酯含量比ZS组高近200%，总酮含量也显著增加。ZUS组与癸酸甲酯和乙酸异戊酯（rOAV≥1）强相关，ZPS组与苯乙醛和辛酸乙酯（rOAV≥1）强相关，ZCS组与丁酸乙酯和β-大马士酮（β-damascenone，rOAV≥1）强相关。PCA分析显示，四个发酵组在香气化合物上明显分离，顺序发酵组赋予葡萄酒更丰富的果香和花香。
**讨论与结论**
讨论部分指出，汉逊酵母的β-葡萄糖苷酶活性受发酵条件（如培养基、乙醇浓度等）影响显著，赤霞珠葡萄汁中酶活性远高于其他培养基（约40 U/mL），提示靶标葡萄汁是筛选最适菌株的关键基质。微卫星分析揭示了基因型与分离来源的关联，但基因型与β-葡萄糖苷酶活性之间未发现直接功能联系，未来需通过全基因组测序和转录组分析探究分子机制。研究结论：通过微卫星分析将409株汉逊酵母分为3个种和11种基因型，基于单菌株和非接触共培养发酵筛选出高β-葡萄糖苷酶活性的H. uvarum FBKL2.9680（基因型UV2）、H. opuntiae FBKL2.9515（基因型OP4）和H. occidentalis FBKL2.9H25（基因型OC1），在赤霞珠顺序发酵中显著提升酯类和酮类含量，并与特定香气化合物（如ZCS组的丁酸乙酯和β-大马士酮）强相关，表明这些菌株在提升葡萄酒香气品质方面具有重要潜力。然而，商业化前仍需进行不同葡萄品种的中试发酵及感官评价，并进一步筛选具有稳定β-葡萄糖苷酶活性的菌株。
