辣木叶多糖通过抑制糖酵解介导的M1巨噬细胞极化缓解溃疡性结肠炎

《Journal of Functional Foods》：Moringa oleifera leaf polysaccharide alleviates ulcerative colitis by inhibiting glycolysis mediated M1 macrophages polarization

　　

目的 研究人员旨在研究辣木叶多糖（MOLP）在溃疡性结肠炎（UC）中的治疗效果及其涉及巨噬细胞极化的潜在机制。
方法 采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型以及脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）刺激的巨噬细胞（PMA分化的THP-1细胞）进行研究。通过测量小鼠的疾病活动指数（DAI）、髓过氧化物酶（MPO）活性和组织学形态评估MOLP的治疗效果，以5-氨基水杨酸作为阳性对照。通过流式细胞术和免疫荧光染色测定巨噬细胞。通过测量乳酸含量、细胞外酸化率（ECAR）和荧光脱氧葡萄糖类似物2-NBDG的摄取来测定糖酵解活性。
结果 MOLP有效缓解了DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症状，表现为DAI评分和MPO活性降低、结肠缩短减轻以及结肠组织病理损伤缓解。此外，MOLP降低了M1巨噬细胞的比例及其特异性因子（TNF-α、IL-1β和iNOS）的mRNA表达，同时增加了M2巨噬细胞及其特异性因子（CD206、Arg1和Chil3）。在LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞中，MOLP处理通过抑制糖酵解活性抑制了M1巨噬细胞极化，这通过糖酵解抑制剂2-DG得到证实。机制上，MOLP下调了HMGB1，而重组HMGB1蛋白处理可抵消MOLP对UC的疗效。此外，HMGB1与HAVCR2相互作用，后者通过PI3K/Akt/HIF-1α通路介导巨噬细胞糖酵解，从而调节M1巨噬细胞极化。
结论 MOLP可通过HMGB1/HAVCR2介导的糖酵解调节巨噬细胞M1极化，从而缓解UC。

溃疡性结肠炎（UC，一种慢性炎症性肠病）是一种以结直肠持续性炎症为特征的复发性疾病，全球患病率持续上升，但现有治疗手段（如皮质类固醇）存在副作用，约10%–20%的难治性病例仍需手术干预。因此，寻找更安全、经济的替代疗法至关重要。巨噬细胞（核心免疫调节细胞）的异常极化（M1促炎表型与M2抗炎表型失衡）是驱动UC慢性炎症和黏膜损伤的关键因素，而M1型巨噬细胞依赖增强的糖酵解（葡萄糖分解代谢途径）获取能量。辣木叶多糖（MOLP）具有抗炎、抗氧化和免疫调节活性，前期研究提示其可能通过抑制炎症反应改善实验性结肠炎，但具体机制尚不明确。本研究旨在阐明MOLP是否通过调控糖酵解介导的巨噬细胞极化及HMGB1/HAVCR2轴（信号通路分子）来缓解UC，相关成果发表于《Journal of Functional Foods》。

研究人员开展了一系列体内外实验。在体内，采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性结肠炎小鼠模型，并以5-氨基水杨酸（5-ASA）为阳性对照，评估MOLP的疗效，同时通过慢病毒过表达HAVCR2（一种免疫调节受体）验证其作用。在体外，利用脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人THP-1源性巨噬细胞建立M1极化模型，通过糖酵解抑制剂2-DG、转录抑制剂放线菌素D（Act D）及PI3K抑制剂LY294002探讨机制。主要技术方法包括：MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和HPLC（高效液相色谱）分析多糖结构；生物信息学分析（基于GSE66407数据集，包含161例UC患者和99例对照）筛选差异表达基因、UC相关基因及MOLP靶点，构建蛋白互作网络（PPI）；流式细胞术和免疫荧光染色检测巨噬细胞表型；Seahorse分析仪测定细胞外酸化率（ECAR）评估糖酵解速率；免疫共沉淀（Co-IP）验证HMGB1与HAVCR2的相互作用。动物实验经扬州大学动物伦理委员会批准。

研究结果如下：

**3.1. MOLP的结构表征**：MALDI-TOF-MS显示MOLP的寡糖片段分子量范围为740–2632 Da，主峰间质量差约162 Da，提示由己糖重复单元构成；HPLC鉴定MOLP为杂多糖，含半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸；FT-IR（傅里叶变换红外光谱）显示典型多糖吸收峰。

**3.2. MOLP治疗改善了DSS诱导小鼠的UC症状**：MOLP（尤其高剂量100 mg/kg）显著降低疾病活动指数（DAI）评分和髓过氧化物酶（MPO）活性，减轻结肠缩短和组织病理损伤（如隐窝丢失、炎性细胞浸润），并上调肠上皮屏障蛋白MUC2和Occludin的表达，效果与5-ASA相当。

**3.3. MOLP减少了DSS诱导UC小鼠中炎症性M1巨噬细胞的浸润**：免疫荧光和qRT-PCR显示，MOLP降低M1巨噬细胞（CD68⁺iNOS⁺）比例及其特异性因子（TNF-α、IL-1β、iNOS）mRNA水平，同时增加M2巨噬细胞（CD68⁺CD206⁺）比例及其因子（CD206、Arg1、Chil3）表达；流式细胞术进一步证实MOLP降低CD86⁺（M1）细胞比例，升高CD206⁺（M2）细胞比例。

**3.4. MOLP通过抑制糖酵解减少巨噬细胞向M1表型极化**：在LPS/IFN-γ刺激的M1巨噬细胞中，MOLP（60和90 μg/mL）降低葡萄糖摄取（2-NBDG荧光强度）、糖酵解酶基因（Glut1、Pdk1、Aldolase）mRNA及关键蛋白（HK2、LDHA）表达，减少乳酸含量和ECAR；糖酵解抑制剂2-DG模拟了MOLP的上述效应，且MOLP与2-DG联合作用无叠加，表明MOLP通过抑制糖酵解阻断M1极化。

**3.5. MOLP在UC中调控HMGB1**：生物信息学分析从127个核心基因中筛选出HMGB1（高迁移率族蛋白B1，一种促炎分子），其在UC样本中表达上调，且与糖酵解活性评分相关。MOLP降低UC小鼠结肠组织和血清中HMGB1的mRNA及蛋白水平，并通过加速mRNA降解（Act D实验）实现转录后调控。分子对接显示MOLP单糖成分与HMGB1结合弱，但使用重组HMGB1蛋白（rHMGB1）可抵消MOLP对UC症状的缓解作用（DAI评分、MPO活性、结肠长度、病理损伤），证实MOLP靶向HMGB1发挥疗效。

**3.6. HAVCR2与HMGB1相互作用并与糖酵解活性相关**：在127个核心基因中，HAVCR2（又称Tim-3）与HMGB1互作评分高，且与糖酵解活性评分显著相关。UC小鼠和M1巨噬细胞中HAVCR2表达升高，MOLP使其降低。Co-IP证明HAVCR2与HMGB1可相互免疫共沉淀，MOLP降低其共沉淀水平；免疫荧光显示两者在M1巨噬细胞中共定位，MOLP减弱共定位。

**3.7. HAVCR2通过PI3K/AKT/HIF-1α通路调控巨噬细胞糖酵解**：MOLP抑制M1巨噬细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值及HIF-1α（缺氧诱导因子-1α）蛋白水平；过表达HAVCR2逆转MOLP的抑制作用，而PI3K抑制剂LY294002可拮抗HAVCR2过表达引起的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT升高及糖酵解关键酶HK2、LDHA上调，但不影响HAVCR2本身表达。

**3.8. MOLP通过HMGB1/HAVCR2介导的糖酵解调控M1极化缓解UC**：在DSS诱导的UC小鼠中，过表达HAVCR2显著抵消MOLP对体重下降、DAI评分、MPO活性、结肠缩短及病理损伤的改善作用，同时逆转MOLP对M1（TNF-α、IL-1β、iNOS）和M2（CD206、Arg1、Chil3）标志物及CD68⁺CD80⁺（M1）细胞比例的调节，并阻断MOLP对糖酵解酶基因、HK2/LDHA蛋白、乳酸含量及PI3K/AKT/HIF-1α通路的抑制作用。

讨论部分指出，MOLP可能通过肠道菌群代谢产生短链脂肪酸（SCFAs）增强生物利用度，但本研究未直接分析菌群组成和SCFAs，为局限性。MOLP通过抑制HMGB1/HAVCR2轴介导的糖酵解，减少M1极化、促进M2极化，从而维持结肠稳态。HMGB1作为炎症驱动因子，在UC中上调，MOLP靶向HMGB1；HAVCR2作为HMGB1受体，通过PI3K/AKT/HIF-1α通路调控糖酵解。研究还讨论了剂量转换（小鼠100 mg/kg相当于人60 kg约486 mg/天，约需5 g辣木叶），并指出DSS急性模型难以反映慢性病程、MALDI-TOF-MS仅反映寡糖片段而非完整多糖分子量、以及靶点预测基于单糖成分的局限性。

研究结论翻译：本研究证明了MOLP的抗UC效应及其潜在机制。MOLP通过抑制巨噬细胞向M1表型极化来抑制DSS诱导的结肠炎肠道炎症，而这种对巨噬细胞的调节是通过抑制其糖酵解活性介导的。此外，本研究还提供了HMGB1/HAVCR2两个分子靶点，以理解MOLP对UC的治疗作用。总之，本研究表明MOLP通过HMGB1/HAVCR2介导的糖酵解抑制巨噬细胞M1极化，从而缓解UC。