早期生命阶段加剧淡水腹足类对农业杀菌剂丙环唑的生态毒理学脆弱性

《Journal of Hazardous Materials》：Early-Life Stages Amplify the Ecotoxicological Vulnerability of Freshwater Gastropods to the Agricultural Fungicide Prochloraz

　　

摘要丙环唑（PCZ）是一种广泛使用的咪唑类杀菌剂，但其在稻田水生环境中对非靶标淡水腹足类动物的生态危害仍理解不足。本研究评估了 PCZ 对福寿螺（*Pomacea canaliculata*）依赖于发育阶段的急性毒性和成体亚致死反应。与新孵化幼螺相比，成体对 PCZ 的敏感性较低，基于名义浓度的 96 小时半数致死浓度（LC??）和复合生理抑制中浓度（IC??）值分别为 0.51 和 0.46 mg L?1，而成体分别为 2.62 和 1.84 mg L?1。PCZ 还在两个生活史阶段均诱导了逃避行为、复合生理抑制并降低了存活率。在 21 天的慢性暴露期间，成体表现出壳高和体重生长受抑。暴露 48 小时后，肝胰腺 ROS 水平升高，特别是在 0.5–2.0 mg L?1 浓度下，并伴随特定的抗氧化基因反应，包括在选定浓度下 SOD 和 GPx 的上调、CAT 的抑制，以及在较高浓度下 GST 的下调。典型的定性组织病理学观察提供了成体多组织结构改变的支持性证据。总体而言，PCZ 在福寿螺中诱导了依赖于发育阶段的毒性，早期生活史阶段比成体更脆弱。这些发现表明，结合早期生活史阶段终点可能改善实验室中对淡水腹足类动物 PCZ 危害的识别，而野外水平的生态风险需要在环境现实暴露情景下进一步评估。

引言丙环唑（PCZ）是一种广谱咪唑类杀菌剂，广泛用于控制水稻、水果、蔬菜及其他重要经济作物的真菌病害 [1], [2]。在水稻生产系统中，化学防治仍然是病害管理的重要策略；然而，杀菌剂的长期和广泛使用可能对非靶标水生生物构成潜在风险 [1], [3]。PCZ 属于脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂，主要通过抑制细胞色素 P450 依赖性 14α-脱甲基酶发挥作用，从而破坏真菌固醇生物合成并抑制镰刀菌（如 Fujikuroi 镰刀菌）等真菌植物病原体的生长 [1]。近年来，包括 PCZ 在内的多种农药已在环境基质和农产品中被检出。例如，在浙江省铁皮石斛（一种药用兰科/作物植物）样品中发现了复杂的农药残留，部分浓度超过了监管限值 [4]。此外，受农业影响的水生系统农药监测研究报告称，地表水和地下水中存在多种农药残留。例如，Barbieri 等报道在 Llobregat 河检测出 28 种农药，在 Ter 河检测出 7 种农药，Llobregat 河农药总浓度范围为 205 至 1813 ng L?1，Ter 河地表水最高达 112 ng L?1，地下水最高达 34 ng L?1 [3]。尽管稻田水中直接针对 PCZ 的监测数据仍然有限，但这些测定的存在数据表明，农业农药残留可以进入接受农业投入的水生环境。由于其环境持久性，PCZ 可能通过喷雾漂移、农业径流和灌溉排水进入稻田及相邻水体，从而为非靶标水生生物创造潜在暴露风险。

现有证据表明，PCZ 可在非靶标生物中诱导一系列毒效应，包括内分泌干扰、氧化应激、代谢紊乱和组织损伤。大多数现有研究集中在脊椎动物系统，特别是鱼类模型上，在这些模型中，PCZ 已被证明会破坏性别分化、改变代谢稳态并调节抗氧化反应 [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]。在甲壳动物大型溞（*Daphnia magna*）中，亚慢性 PCZ 暴露诱导了能量代谢紊乱和跨代表型异常 [13]。PCZ 相关内分泌和发育毒性的证据也在哺乳动物和鸟类模型中有所报道 [2], [14], [15], [16]。在机制上，PCZ 可以通过抑制类固醇生成酶（如 CYP17 和 CYP19）以及拮抗性激素受体来干扰内分泌功能 [2], [5], [8], [14]。与此同时，PCZ 可能引起多层次毒性反应，包括氧化应激、能量代谢失衡和组织损伤 [6], [7], [9], [11], [16], [17]。然而，对于淡水软体动物，特别是稻田腹足类动物，仍存在重要的知识空白。与脊椎动物、甲壳动物和哺乳动物或鸟类模型相比，腹足类动物在 PCZ 生态毒性研究中代表性不足，目前尚不清楚不同生活史阶段是否表现出敏感性差异，或者早期生活史急性毒性是否与成体亚致死反应（如生长抑制、氧化应激、抗氧化相关基因表达和组织水平损伤）相关。解决这些空白很重要，因为稻田腹足类动物可能通过农业径流和灌溉排水暴露于杀菌剂残留中。

福寿螺（*Pomacea canaliculata*）原产于南美洲，自 20 世纪 80 年代引入以来，已逐渐扩散到中国南方的稻田、灌溉沟渠、湖泊及其他水生栖息地 [18], [19]。由于其高繁殖能力、广泛的食性、强环境适应能力以及通过自然和农业途径扩散，福寿螺已成为水稻生产系统中的主要入侵农业害虫 [20], [21], [22], [23], [24]。除了作物损害外，福寿螺还能影响底栖栖息地，并作为广州管圆线虫的中间宿主具有公共卫生意义 [19], [25], [26], [27]。更重要的是，对于本研究而言，其与水稻生产系统的密切关联、实验室维护的便利性、丰富的产卵量以及早期生活史和成体阶段的可用性，使福寿螺成为适用于生态毒理学评估的与稻田相关的淡水腹足类模型 [18], [20], [21], [22], [23], [24]。这些特征允许将依赖于生活史阶段的急性反应与成体亚致死终点（包括生长、氧化应激、抗氧化相关基因表达和组织水平改变）相结合。

软体动物在淡水生态系统中发挥着重要的生态作用。由于分布广泛、对环境变化敏感且物种多样性丰富，它们常被用作环境毒理学研究中的指示类群 [28], [29], [30]。作为代表性的淡水腹足类动物，福寿螺表现出特征明确的免疫防御机制，特别是血细胞介导的反应 [31], [32]。水生生物对外源化学物的敏感性在发育阶段之间可能有所不同；因此，早期生活史阶段测试在 aquatic ecotoxicology 中被广泛用于评估化学诱导的发育和亚致死效应 [30], [33]。以前的 PCZ 研究已报道了非靶标生物中的氧化应激、代谢紊乱和组织损伤 [6], [7], [9], [11], [16], [17]，这支持了选择 ROS 水平、抗氧化相关基因表达和组织病理学分析作为补充的生物化学、分子和组织水平终点。然而，关于福寿螺中 PCZ 毒性依赖于发育阶段差异的研究仍然有限，特别是缺乏将早期生活史急性行为学和致死终点与成体慢性生长、氧化应激相关反应、抗氧化相关基因表达和组织病理学改变相结合的综合评估。

基于上述知识空白，我们假设 PCZ 在福寿螺中的毒性将依赖于生活史阶段，新孵化幼螺比成体表现出更高的急性敏感性。我们进一步假设，21 天的成体暴露将诱导生长抑制和代表性组织改变，而单独的 48 小时成体暴露测试将诱导氧化应激相关反应和抗氧化相关基因表达改变。为了检验这些假设，本研究使用福寿螺作为测试生物，比较了新孵化幼螺和成体之间 PCZ 的急性毒性。在单独的成体暴露测试中，我们进一步评估了暴露 21 天后的生长和组织反应，以及暴露 48 小时后的肝胰腺 ROS 水平和抗氧化相关基因表达。通过整合行为学、生长、生物化学、分子和定性组织病理学终点，本研究旨在表征淡水腹足类动物中 PCZ 的发育阶段依赖性毒性及其氧化应激相关反应，从而为稻田水生环境中农业杀菌剂残留的危害识别提供基于效应的证据。

节选
生物伦理本研究使用的实验生物是无脊椎动物福寿螺，采集自自然稻田并在实验室条件下驯化。所有程序均符合《实验动物管理条例》、《实验室动物福利伦理审查办法（2023）》和 ARRIVE 2.0 报告指南，以及实验室动物护理的标准操作程序（SOPs）

PCZ 暴露诱导福寿螺新孵化幼螺的行为应激、生理抑制和急性致死性
在急性暴露条件下，PCZ 首先诱导福寿螺新孵化幼螺出现明显的逃避反应。PCZ 暴露后逃避个体数量增加，且随着暴露时间延长变得更加明显，但在所有时间点下，该反应在各浓度间并非严格单调（图 1A）。逃避率的热图进一步显示，在早期暴露期（0.5 至 1 小时），逃避反应相对较弱，但随后显著增强

讨论PCZ 是一种广泛用于农业和园艺生产的代表性咪唑类杀菌剂。其咪唑环可与细胞色素 P450 依赖性过程相互作用，这构成了其通过抑制麦角固醇生物合成发挥杀菌作用的基础，同时也解释了其干扰非靶标生物中 P450 介导代谢过程的潜力 [1], [2], [14]。以前的研究表明，PCZ 可以影响类固醇生成途径，包括 CYP17A1 和 CYP19 等酶

结论通过整合特定生活史阶段的急性毒性与在单独 48 小时和 21 天暴露测试中测量的成体亚致死反应，本研究确定发育阶段是福寿螺中 PCZ 毒性的重要决定因素。新孵化幼螺的较高敏感性表明，仅基于成体的毒性评估可能低估了对早期生活史阶段的危害，而成体生长抑制、氧化应激相关反应、抗氧化相关转录变化和环境

环境意义丙环唑在农业生产中广泛使用，但其对稻田水生生态系统中非靶标淡水腹足类动物的生态危害仍理解不足。本研究证明，福寿螺的新孵化幼螺对丙环唑的敏感性显著高于成体，表明基于成体的毒性终点可能无法充分表征对早期生活史阶段的危害。通过整合行为反应、生理抑制、急性致死性、

资助本研究由国家自然科学基金（批准号 32000293）、广西自然科学基金（批准号 2020JJA130077 和 2018JJB140423）、浙江树人大学校级科研项目（批准号 2022R064）以及浙江省医药卫生科技计划项目（批准号 2024KY925）资助。

CRediT 作者贡献声明
李海润：可视化，验证，方法论。
王济元：写作 – 初稿，可视化，验证，软件，方法论，调查。
姚岩来：验证，软件，方法论。
许嘉璐：软件，方法论，调查。
王若可：可视化，验证。
陈林伟：可视化，调查。
邵玉清：可视化，验证。
张小芬：监督，形式分析，数据整理。
杨璐：软件，调查。
林丽军：监督，资助

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢
作者感谢浙江树人大学树兰国际医学学院的员工对蜗牛护理和采样的支持和协助。

重要性声明
丙环唑在农业生产中广泛使用，但其对非靶标淡水腹足类动物的危害仍理解不足。本研究显示，福寿螺的新孵化幼螺对丙环唑的急性敏感性高于成体，表明基于成体的毒性终点可能无法充分表征

王济元 | 李海润 | 许嘉璐 | 姚岩来 | 陈林伟 | 王若可 | 邵玉清 | 杨璐 | 张小芬 | 姚晓东 | 林丽军 | 李红宇
浙江省器官与计算医学重点实验室，浙江树人大学树兰国际医学学院，杭州，中国