基于无标记四维共聚焦拉曼成像的活体斑马鱼微塑料多重识别

《Journal of Hazardous Materials》：Label-free 4D Confocal Raman Imaging Enabling In Vivo Multiplex Identification of Microplastics in Zebrafish

　　

自然环境中的微塑料通常以由各种聚合物类型组成的异质混合物形式存在。然而，目前的活体成像技术往往局限于单组分追踪或涉及侵入性的荧光标记，无法支持在活体条件下对多种未标记微塑料进行同步识别。在本研究中，研究人员通过开发一套无标记四维共聚焦拉曼成像系统应对了这一挑战。该系统具有高空间分辨率（~500 nm）和宽波数覆盖范围（500–3200 cm^-1）。它能够对活体斑马鱼中的外源性微塑料和内源性生物分子（如脂质和蛋白质）进行具有化学特异性的成像。研究人员可视化展示了斑马鱼内源性生物分子信号的分布模式，并进一步验证了对五种常见微塑料（PA、PE、PS、PET和PMMA）的多重识别能力，在暴露于该五聚合物混合物的活体斑马鱼中实现了对摄入聚合物类型的体内鉴别。此外，研究人员利用检测到的拉曼阳性体素计数来评估相对颗粒丰度，并动态监测了这些混合微塑料的摄入、积累和排泄过程。结果显示，不同聚合物类型之间存在明显的保留行为差异，微塑料在暴露8小时后在肠道中表现出显著的积累。本研究建立了一套稳健且高精度的分析方法，用于分析聚合物特异性摄入差异以及混合塑料污染物的体内积累，为评估微塑料生物积累动态提供了强大的分析工具。

微塑料作为全球生态系统中普遍存在的污染物，在自然环境中通常以多种聚合物（如PE、PS和PA）的异质混合物形态存在。鉴于生物体在自然环境下长期暴露并同时摄入多种不同类型的微塑料，为准确评估其生态与健康风险，亟需不仅确认颗粒的摄入，还必须特异性地识别积累颗粒的类型，并表征其在体内的空间分布与代谢动态。斑马鱼因其幼虫期的高光学透明性以及与哺乳动物高度同源的消化代谢途径，成为研究微塑料与生物相互作用的理想脊椎动物模型。然而，当前活体原位研究主要依赖荧光标记的模型颗粒，染料浸出及表面化学改变易导致实验伪影；现有的拉曼光谱技术多用于离体分析，而相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）等无标记成像技术的光谱覆盖范围较窄，难以在复杂活体生物背景下对特征高度重叠的多种微塑料进行准确区分。因此，开展能够实现宽光谱覆盖和高空间分辨率的活体多重微塑料识别技术研究具有迫切的必要性。此项研究由研究人员开展并发表于《Journal of Hazardous Materials》。

为开展此项研究，研究人员主要开发并利用了以下几项关键技术方法：首先，自主搭建了一套四维共聚焦拉曼成像系统，该系统采用532 nm单色连续波激光激发，结合二维振镜与高精度位移台实现了三维空间信息与拉曼光谱数据的同步采集；其次，引入了基于三维卷积和编码器-解码器架构的端到端深度学习网络模型，用于处理高维高光谱图像以实现对微塑料种类的像素级语义分割与精准分类；最后，建立了一种基于拉曼阳性体素计数的体素分析方法，用于量化评估混合微塑料的相对丰度及动态分布过程。研究使用的野生型斑马鱼胚胎来源于国家斑马鱼资源中心，微塑料样本则为尺寸15 μm的PA、PE、PS、PET和PMMA标准品。

在研究结果方面，研究分为几个核心部分：

4D Confocal Raman Imaging of Multiple Microplastic Samples（多种微塑料样本的四维共聚焦拉曼成像）：通过4D-cRI系统对五种标准微塑料（PA、PE、PS、PET和PMMA）进行成像，研究人员成功重构了它们的三维形态，并在高信噪比下提取了特征拉曼光谱。结合深度学习分类网络，该模型在独立验证集上对五种微塑料的预测准确率均超过98%。在复杂混合样本的验证中，系统不仅清晰解析了空间分布，还利用低波数区域的拉曼特征有效区分了具有相似官能团的聚合物。通过分层和总体体素计数统计，证实了该系统能够定量评估混合微塑料的相对丰度及深度分布差异。

In vivo Label-free Raman imaging of Biological Molecules and Microplastics in Zebrafish（斑马鱼体内生物分子与微塑料的活体无标记拉曼成像）：研究人员利用生物内源性拉曼信号对活体斑马鱼进行无标记成像。对照组中成功绘制了脂质（2850 cm^-1）和蛋白质（1552 cm^-1）的化学分布图。在微塑料暴露组的融合图像中，可清晰观察到内部化的微塑料与周围组织的界限，经拉曼光谱提取特征指纹（1725 cm^-1对应PET的C=O伸缩振动）确认了微塑料的内化，排除了组织自发荧光的干扰。

Dynamic Monitoring of Multiple Microplastic Accumulation and Excretion in Living Zebrafish（活体斑马鱼中多种微塑料积累与排泄的动态监测）：将斑马鱼暴露于五种微塑料混合液中，研究人员根据拉曼特征识别并可视化了活体内摄入的聚合物类型。3小时暴露后，肠道出现离散微粒信号；8小时暴露后，肠道内出现大规模混合聚集体；转移至清水培养8小时恢复后，拉曼信号几乎完全消失。这表明15 μm尺寸的微塑料主要滞留在肠腔内，可通过自然生理排泄清除。体素统计分析揭示，受密度和表面性质影响，斑马鱼对PS和PE的摄入倾向明显高于PA和PMMA。

在讨论与结论部分，研究人员总结指出，本研究成功开发并应用了一套无标记4D共聚焦拉曼成像方法，实现了在活体斑马鱼中多种不同微塑料的同步识别和空间映射。该系统具备高空间分辨率和宽光谱覆盖特性，能够同时对外源性微塑料和内源性生物分子进行化学特异性成像。基于拉曼阳性体素计数的体素分析方法，成功可视化展示了混合微塑料从初始摄入到大规模积累最终有效排泄的全过程，并证实了肠腔滞留行为。该技术克服了传统单标准暴露模型的缺陷，为探究复杂多组分微塑料暴露在模式生物中的摄入差异与短期积累动态提供了一套高精度、具有前瞻性的分析工具。