《Advanced Materials》：Elastomeric 3D-Printed Microenvironments Enable Nanonewton Force Measurements in Healthy and Diseased Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neuroepithelial Cells
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在神经发育过程中，细胞在迁移和分化时在其微环境内产生机械力并对其作出响应。这些力对于人脑发育至关重要，因为它们被转化为调控关键神经生物学过程的细胞内信号，并可能参与病理过程。然而，在三维（3D）微环境中测量纳牛顿（nN）范围内的此类力在技术上仍具有挑战性且计算
在神经发育过程中，细胞在迁移和分化时在其微环境内产生机械力并对其作出响应。这些力对于人脑发育至关重要，因为它们被转化为调控关键神经生物学过程的细胞内信号，并可能参与病理过程。然而，在三维（3D）微环境中测量纳牛顿（nN）范围内的此类力在技术上仍具有挑战性且计算密集。在此，研究人员提出了一种基于通过双光子聚合（2PP）制备的弹性体3D微结构以及定制湿法蚀刻工艺的解决方案。所得的自支撑梁结构能够量化全能干细胞源性神经上皮祖细胞施加的nN力。研究人员使用共聚焦活细胞成像显微镜、扫描电子显微镜（SEM）以及原子力显微镜（AFM），结合内部开发的亚像素分辨率强度偏转测量程序，表征了细胞形态及其施加的力。利用该平台，研究人员精确量化了来自健康神经细胞以及携带与结节性硬化症（TSC）相关的TSC2基因突变的神经细胞的神经元牵引力，低至1.2 nN。所提出的弹性体微环境为研究细胞骨架力学、3D神经机械生物学以及开发体外疾病治疗模型铺平了道路。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
神经发育受化学、物理、电学和机械信号的复杂交互调控。过去几十年，化学信号对神经发生和神经发育的影响已得到广泛研究，但机械信号（如细胞外基质（ECM）刚度、静水压力、流体剪切应力和拉伸力）的作用相对未被充分探索。在发育中的大脑中，拉伸力源于细胞-细胞和细胞-ECM相互作用，调控神经上皮干细胞（NES）的增殖、迁移和分化，并通过机械转导机制转化为细胞内信号。机械力调节的关键作用已被揭示，例如，拉伸敏感离子通道Piezo1的激活影响神经干细胞的谱系决定。此外，机械力还塑造神经元形态和连接性，其异常与多种神经系统疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症。细胞骨架功能障碍被认为是帕金森病发病的机制之一，而机械转导改变在胶质母细胞瘤中也有报道。然而，目前研究大多聚焦于神经细胞对外加力的响应，而对细胞自身产生的力研究较少。结节性硬化症（TSC）由TSC1或TSC2基因突变引起，导致mTOR信号通路和细胞骨架紊乱，已知影响细胞形态、突起生长和迁移，但其对细胞施加力的影响尚不清楚。现有测量细胞牵引力的方法，如微柱阵列、牵引力显微镜（TFM）、原子力显微镜（AFM）和牵引针，通常迫使细胞在二维（2D）或2.5D环境中生长，导致细胞扁平化，不能代表体内三维（3D）脑组织构型。3D TFM部分解决了这一问题，但实验复杂且对水凝胶成分、批次差异、刚度、溶胀、降解和pH敏感，影响测量准确性和可重复性。因此，需要一种能够在3D微环境中以纳牛顿灵敏度测量活细胞力学输出的平台。
**研究内容与主要结论**
研究人员提出了一种基于弹性体3D打印微环境的方法，用于测量健康与疾病状态人全能干细胞（iPSC）源性神经上皮细胞（NES）施加的纳牛顿（nN）力。该平台通过双光子聚合（2PP）制备弹性体聚二甲基硅氧烷（IP-PDMS）微结构，并结合四正丁基氟化铵（TBAF）湿法蚀刻后处理，以降低梁的横截面尺寸，提高力灵敏度。利用该平台，研究人员结合活细胞共聚焦显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）表征了细胞形态和力，并量化了健康对照和携带TSC2基因突变的NES细胞的牵引力，发现两者平均力无显著差异（健康：6.50±3.41 nN；TSC2：6.35±3.34 nN），表明尽管存在已知的细胞骨架异常，但TSC2突变细胞的基线机械力输出可能得以保留，或存在补偿机制。该论文发表在《Advanced Materials》。
**主要关键技术方法**
1. **双光子聚合（2PP）**：使用IP-PDMS光交联弹性体树脂，通过2PP制备自支撑双锚定微梁阵列，梁长75 μm，标称宽0.8 μm，单像素高度约3.3 μm，打印在ITO导电玻璃基底上。
2. **TBAF湿法蚀刻**：使用0.57 M TBAF在DMSO中蚀刻1分钟，将梁宽度减少至710±30 nm，高度约2.3±0.05 μm，以降低弹簧常数，提高力灵敏度。
3. **力学表征**：利用AFM在空气和生理成像介质中测量梁的弹簧常数（含水环境约0.0023 N/m），并结合干涉仪基纳米压痕和AFM力映射测量IP-PDMS的杨氏模量（AFM: 6.1±0.53 MPa; 纳米压痕: 2.9±0.07 MPa）。
4. **活细胞共聚焦成像与力分析**：使用SPY650-FastAct标记F-肌动蛋白，采集64小时时间序列z-stack，基于IP-PDMS自荧光通过半自动MATLAB程序实现亚像素精度的梁偏转量化，并利用欧拉-伯努利梁理论计算等效点力。
5. **样本队列来源**：使用5个健康对照细胞系和3个TSC2患者源性iPSC系（来自Coriell Institute），均分化至NES细胞。
**研究结果**
**2.1 力敏感结构的设计与制备**
**2.1.1 3D打印平台的双光子聚合**：通过优化打印参数（激光功率40-50 mW，扫描速度3-5 mm/s），制备了长度为约70 μm、宽度1.05±0.07 μm、高度2.96±0.07 μm的IP-PDMS梁，并通过SEM确认尺寸。
**2.1.2 TBAF湿法蚀刻**：在0.57 M TBAF蚀刻1分钟后，梁宽度降至710±30 nm，高度约2.3±0.05 μm，且拉曼光谱和AFM表面粗糙度测量表明蚀刻过程未显著改变化学结构或纳米形貌。
**2.1.3 数值分析与有限元建模**：基于欧拉-伯努利梁理论和有限元模拟（FEM），预测梁在1 nN载荷下最大偏转约1.26 μm，理论弹簧常数为2.8×10?? N/m，FEM结果为7.9×10?? N/m，与实验值一致。
**2.2 力敏感结构的实验表征**：通过AFM在含水环境中测量梁的弹簧常数为0.0023 N/m，在37°C生理成像介质中培养53小时后刚度无显著变化，表明IP-PDMS梁在64小时活细胞实验尺度内力学稳定。与现有3D打印力传感器相比，该平台具有更高的灵敏度（0.0023 N/m）。
**2.3 固定细胞共聚焦显微镜与SEM成像**：共聚焦显微镜显示NES细胞能在低密度（5000-15000 cells/cm2）下黏附于梁并桥接相邻梁，SEM确认细胞在3D微环境中扩展并诱导梁变形（尽管固定脱水可能引入伪影）。
**2.4 活细胞共聚焦显微镜与细胞力分析**：通过活细胞共聚焦（64小时）和MATLAB亚像素偏转分析，量化了健康对照和TSC2细胞对梁的偏转和力。健康细胞平均偏转2.46±1.27 μm（对应力6.50±3.41 nN），TSC2细胞平均偏转2.35±1.33 μm（对应力6.35±3.34 nN），两者无显著差异（p=0.65，Cohen's d效应量极小）。此外，该平台还能检测Z方向（面外）偏转，但仅少数样本出现。与2D TFM相比，该平台具有重现性好、无需反演计算、可直接测量3D力的优点。
**结论与讨论**
研究人员总结讨论部分指出，该平台首次实现了在3D弹性体微环境中以nN灵敏度量化人iPSC源性NES细胞施加的力，并对比了健康和TSC2突变细胞。尽管TSC2突变已知导致细胞骨架紊乱，但未观察到力输出的显著差异，可能源于细胞存在补偿机制（如mTORC1超活化通过RhoA调控或FAK磷酸化促进黏着斑成熟），或细胞更倾向于调控位移而非力本身。研究结论部分翻译为：“在这项工作中，研究人员介绍了一种通过IP-PDMS的双光子聚合（2PP）结合可控湿法蚀刻方案制备的弹性体、力学表征的3D力传感平台。这种两步法实现了亚微米、柔顺梁的制备，具有优异的弯曲灵敏度，同时保持结构完整性和化学稳定性。通过将这些工程化微结构与活细胞共聚焦成像和基于MATLAB的亚像素偏转分析相结合，研究人员在完全3D环境中实现了对细胞产生力的单nN范围内可靠量化。研究人员证明，人iPSC源性NES细胞易于黏附并变形打印结构，实现长时间成像周期内的连续力测量。尽管存在与TSC2突变相关的已知细胞骨架异常，但在测试条件下，TSC2源性NES细胞的力输出与健康对照组无显著差异。这一发现表明，这些细胞中基线机械生物学力产生得以保留，或者尽管存在细胞骨架改变，但补偿机制稳定了力产生。总体而言，该平台提供了一种灵敏、可重复且生理相关的方法，用于在3D环境中研究神经细胞机械生物学。除了能够直接比较健康与疾病模型神经细胞之外，该方法还为进一步研究细胞内力动态、ECM-细胞机械相互作用以及机械转导通路提供了广泛潜力。凭借其高灵敏度和与活细胞成像的兼容性，该系统是研究神经疾病模型生物物理机制的重要一步。”
