一种以电生理信号编码机械与热刺激的神经化人类皮肤等效物

《Advanced Science》：An Innervated Human Skin Equivalent that Electrically Encodes Mechanical and Thermal Stimuli

　　

理解外周感觉回路如何编码机械和热刺激，需要一个将天然组织结构与高分辨率电生理读数相结合的实验系统。现有的体外神经化皮肤模型通常依赖于化学刺激和光学测量，限制了其探究感觉编码动力学的能力。在此，研究人员提出了一种能够以电生理方式编码机械和热刺激的神经化全层人类皮肤等效物。该构建体整合了分化的表皮（Epidermis）与真皮，以及形成游离神经末梢样结构的感觉神经元和施万细胞，记录到的电生理活动即源于此结构，且该构建体与高密度微电极阵列相连接。受控的机械压痕和局部热刺激引发了一致的、依赖于刺激的发放模式，其波形形态和时间动力学揭示了机械和热输入截然不同的电生理特征。据研究人员所知，这代表了在工程化神经化人类皮肤构建物中首次证明由热和机械诱发的电生理活动。该模型能够对感觉编码进行受控研究，并在工程化组织与电生理传感技术之间建立了一个具备生物学基础且实验上可控的界面，在仿生触觉传感、神经接口和感觉恢复方面具有潜在应用价值。

研究背景与意义
躯体外周感觉系统通过支配皮肤的特定感觉神经元来检测和区分机械与热刺激，这些神经元将物理输入转化为可被中枢神经系统解释的电生理活动模式。尽管过去的二十年里，研究人员在识别感觉转导的关键分子介质方面取得了重大进展，例如发现了热敏TRP通道和机械敏感Piezo通道，但外周感觉回路如何将物理刺激转化为不同的电生理编码模式，其机制仍未被完全阐明。这一领域的研究进展受到了现有实验模型局限性的严重制约。体内和离体标本虽具有生理相关性，但在可及性、可扩展性和实验控制方面存在限制。相反，还原论式的体外系统（包括解离的神经元培养物和常规皮肤等效物）通常缺乏天然皮肤的结构复杂性，或者无法以足够的空间和时间分辨率记录电生理活动。因此，大多数关于人类体外躯体感觉的研究依赖于化学刺激和钙成像技术，这些方法虽然能报告细胞激活情况，但无法提供感觉编码背后的电生理动力学深入见解。近年来，虽然组织工程的进展使得包含角质形成细胞、成纤维细胞和感觉神经元的神经化人类皮肤等效物得以开发，但对其功能的验证主要集中在分子和光学读数上，在组织水平上对机械或热刺激引起的感觉反应进行直接电生理探测在很大程度上仍未被探索。为了解决这一未满足的需求，研究人员开展了一项研究，旨在开发一种能够电生理编码机械和热刺激的神经化、全层人类皮肤等效物。据研究人员所知，这是首次在工程化神经化人类皮肤构建物中证明热和机械诱发电生理活动的研究。该研究发表于《Advanced Science》，其构建的模型不仅为外周感觉处理提供了机制上的见解，还建立了一个可复现的体外测试平台，可用于躯体感觉编码的研究，并在仿生触觉传感器、神经接口技术以及感觉恢复和人机交互策略的开发与验证方面具有极其重要科学意义和广阔的应用前景。

关键技术方法
研究人员采用了自下而上的组织工程策略构建了神经化人类皮肤等效物。将成纤维细胞接种于多孔明胶微载体上形成真皮微组织，并自组装为人类真皮等效物，随后依次接种人类施万细胞和角质形成细胞以构建全层人类皮肤等效物，并在气液界面培养以促进上皮分层。随后，将新生大鼠背根神经节感觉神经元接种并培养于高密度微电极阵列上，再将其与构建好的皮肤等效物共培养以实现神经化整合。在样本队列来源方面，实验所用的人类真皮成纤维细胞和角质形成细胞提取自aina breast皮肤活检样本，并经University of Naples Federico II和AORN A. Cardarelli的伦理委员会批准。在刺激与读出手段上，研究人员利用定制的机电一体化测试平台施加受控机械压痕和局部热刺激，并通过HD-MEA记录组织层面的电生理信号。研究还通过有限元方法对热传导进行建模分析，结合主成分分析（PCA）处理波形数据，并利用免疫荧光分析进行了分子层面的机制验证。

研究结果

IHSE分子回路对机械和热刺激有响应
为了验证体外IHSE模型中躯体外周感觉回路的功能性激活，研究人员施加了机械和热刺激，并评估了相应的机械和热敏感分子标记物的激活情况。通过免疫荧光分析，研究人员重点关注位于IHSE表皮与真皮界面的游离神经末梢样结构。结果显示，IHSE结构具有明确的角质形成细胞层理和神经轴突向上真皮与表皮的延伸。在机械刺激后，机械敏感离子通道Piezo2的平均荧光强度从非刺激样本的4.55 ± 1.47显著上升至8.29 ± 2.63。在热刺激后，热敏离子通道TRPA1的平均荧光强度从0.95 ± 0.48显著增加至8.43 ± 5.30。这表明IHSE构建物在分子水平上具备检测机械和热输入的能力，为后续的电生理表征提供了坚实的机制基础，也支持了所记录的信号源于体外躯体感觉回路真实激活的预期。

IHSE电回路对机械刺激有响应
在确认基线电生理完整性后，研究人员对IHSE施加了机械刺激。通过施加三次100-μm的压痕刺激，研究人员发现检测到的尖峰数量和活跃电极数量在压痕期间均显著增加，且活跃程度与机械刺激直接相关。定量分析表明，在首次触压期间，检测到的尖峰数量是自发活动的14.68 ± 8.14倍，但随着连续刺激，该响应呈现进行性下降，第三次触压时降至3.62 ± 4.57倍。活跃电极数量也呈现出相似的下降趋势。这种逐渐递减的反应可能依赖于IHSE对重复刺激的适应或随时间的脱敏，这符合伤害感受器在接受重复刺激后脱敏的生理学现象。为验证信号并非流于电极或细胞受压伪影，研究人员对缺失神经元的HSE及未形成FNELS的未成熟共培养物进行了对照测试，均未检测到因压痕诱发的尖峰活动，证实了电生理响应是发育成熟的IHSE模型组织层面感觉转导的直接结果。

IHSE电回路对热刺激有响应
为确定热刺激分析的最佳时间窗口，研究人员首先基于有限元法模拟了内部热传导过程。模拟显示，在接触后的前5秒内，温度变化主要集中在真皮上层的上皮层，而深部真皮中的神经元胞体温度变化较小。据此，研究人员将前5秒定为最佳分析窗口。热刺激实验显示，温暖刺激（45°C）在最初的5秒内诱发了显著的电生理升幅：尖峰数量增加了61%，活跃通道增加了40%；而在刺激60秒后，与自发活动相比，两类参数依然分别存在15%和26%的显著增加。冷刺激（10°C）虽然诱发了反应，但相对微弱，在前5秒内尖峰数量增加了14%，且活跃电极的增加未达统计学显著水平，这可能与室温环境（25°C）差异较小有关。对照实验证实，在接近室温的28°C下进行接触刺激未引起显著性变化，排除了探头接触伪影的影响。

电生理波形序列分析揭示了不同的机械和热刺激模式
为了比较不同刺激诱发的信号特征，研究人员对所有提取出的电生理波形求取了皮尔逊相关系数，结果显示温暖和冷刺激间的相关性最高（0.88 ± 0.09），而机械刺激与热刺激间的相关性略低。通过计算峰宽、振幅、星影谷值及去极化和复极化斜率等波形参数，并进行雷达图分析，发现冷热刺激所产生的波形特征相似，但机械刺激在多个参数上显著不同。利用上述具有显著差异的参数进行主成分分析（PCA），结果表明可根据刺激类型进行部分聚类，机械刺激的波形形成了独特的聚集簇而独立于热刺激。通过计算聚类中心间的马氏距离进行统计比较，证实机械与冷、机械与热之间的波形差异显著，而冷与热之间则无法区分。

结论与讨论
本次研究证明，IHSE能够通过一致的、依赖于特定刺激模式的电生理活动对机械和热刺激进行编码。在构建具备FNELS结构的表皮与真皮之后，研究人员成功在组织水平上实现了对感觉转导的直接测量。不同于以往依赖化学刺激或钙成像的研究，这是首次在工程化体外神经化人类皮肤模型中证明机械与热诱发的感觉电生理响应，弥补了离体标本不可复现且结构复杂的缺陷。由于机械刺激响应具有随刺激发生适应和脱敏的特性，并且在不具备FNELS的对照组中未出现刺激反应，证实这些信号确实源于组织层面的感觉转导过程而非伪影。热传导的有限元模型也进一步证实，电生理信号源于上皮层面的热转导而非直接加热底层的神经胞体。PCA分型分析显示的波形差异亦验证了IHSE在电生理水平上对刺激感受的分化，这与通过上调Piezo2和TRPA1通道进行的分子路径激活完全吻合。虽然未加入药理学拮抗剂阻断作为直接验证，且模型缺乏如触觉小体等专一末梢器官，受限于物种差异使用了大鼠的DRG神经元，但已有前期药理学结果以及占比特征完全支持电生理特征具备生物学合理性。总而言之，这项研究成功建立了一个可在受控实验平台上对物理刺激转化为神经信号进行直接测量和操纵的IHSE平台，在连接生物躯体感觉与工程化传感系统方面迈出了重要一步，为仿生神经接口等领域的后续应用奠定了基础。