ROS-ATM-CBP轴介导的PARP1乳酸化加剧多柔比星诱导的心脏毒性

《Clinical and Translational Medicine》：ROS-ATM-CBP axis-mediated PARP1 lactylation aggravates doxorubicin-induced cardiotoxicity

　　

多柔比星（DOX）是一种有效的抗肿瘤药物，但其临床应用因危及生命的心脏毒性作用而受到限制。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）在氧化应激下将ADP-核糖基团从供体NAD⁺分子转移到靶底物上，这可能促进细胞凋亡和心肌损伤。然而，PARP1激活的详细分子途径仍不清楚。研究人员发现，活性氧（ROS）作为信号分子，以依赖于ATM（共济失调毛细血管扩张症突变蛋白）的方式促进CBP介导的PARP1乳酸化，从而诱导PARP1的PARylation（聚腺苷二磷酸核糖基化）并最终导致细胞凋亡。研究人员鉴定CBP（CREB结合蛋白）和SIRT1分别是PARP1的特异性乳酸转移酶和去乳酸化酶。此外，PARP1的乳酸化依赖于LDHA（乳酸脱氢酶A）的活性和乳酸的产生。此外，心肌特异性CBP敲除小鼠减少了PARP1乳酸化并防止了多柔比星诱导的心功能障碍。研究人员的发现揭示了过度氧化应激诱导的ROS积累通过乳酸化-PARylation级联反应激活ATM-CBP-PARP1信号通路，从而促进细胞凋亡和心肌损伤。

多柔比星（DOX）作为一种强效的抗肿瘤药物，在临床肿瘤治疗中被广泛应用，然而其引发的威胁生命的心脏毒性极大地限制了它的临床应用前景。在氧化应激状态下，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）能够将ADP-核糖基团从供体NAD⁺分子转移至靶蛋白底物上，此过程往往会促进细胞凋亡并加剧心肌损伤。尽管过往已有大量研究证实抑制PARP1的过度激活可减轻心肌损伤，但PARP1激活及其引发细胞死亡的具体分子机制始终未能得到充分阐明。蛋白质翻译后修饰（PTM）在调节蛋白活性、稳定性及折叠过程中发挥关键作用。尽管已知PARP1受到SUMO化、泛素化、磷酸化等多种修饰的影响，但关于其是否发生其他重要PTM仍缺乏深入探究。乳酸曾被单纯视为三羧酸循环中的中间代谢产物，但近期研究表明乳酸可诱发生物体内一种被称为乳酸化的新型PTM，通过修饰赖氨酸残基来改变组蛋白或非组蛋白的功能。虽有研究提及PARP1存在乳酸化修饰，但其发生的分子机制及在心肌损伤中的生理功能依然属于未知领域。为了填补这一研究空白，研究人员开展了本次研究，旨在揭示PARP1乳酸化的调控网络及其在多柔比星诱导的心脏毒性中的作用。研究人员发现，过度氧化应激产生的ROS积累会激活ATM-CBP-PARP1信号通路，通过乳酸化-PARylation级联反应导致心肌细胞凋亡与损伤。本研究深入阐明了PARP1乳酸化诱导细胞死亡的具体分子机制，并证实靶向抑制CBP介导的PARP1乳酸化不仅可显著减轻多柔比星引发的心功能障碍，且不削弱其抗肿瘤效能。这一重要发现为临床防治多柔比星心脏毒性提供了极具潜力的治疗新靶点。该研究成果已发表在国际学术期刊《Clinical and Translational Medicine》上。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了免疫共沉淀联合蛋白质印迹技术以鉴定蛋白互作与修饰水平；结合液相色谱-串联质谱分析精确定位靶蛋白的特异性乳酸化位点；运用体外乳酸化与去乳酸化反应体系验证酶促动力学功能；通过流式细胞术与CCK-8检测评估细胞凋亡与增殖活力；借助超声心动图等影像学手段评估小鼠心功能。本研究所使用的小鼠模型队列来自上海南方模式生物研究中心构建并提供的心肌特异性CBP敲除小鼠和LDHA敲除小鼠。

CBP是PARP1乳酸化的乳酸转移酶。研究人员通过免疫共沉淀实验证实PARP1是一种乳酸化蛋白。在测试多种潜在乳酸转移酶后，发现CBP主要介导了PARP1的乳酸化，且体外酶促实验进一步确认了CBP的催化作用。截断突变分析表明，乳酸化位点主要集中于PARP1氨基酸的203至476区段。基于质谱技术，研究人员鉴定出K203、K209、K221、K337和K425为潜在的乳酸化位点，并构建了5KR突变体。结果表明，5KR突变体显著消除了CBP过表达或抑制引起的PARP1乳酸化水平波动，从而证实CBP是关键乳酸转移酶。

SIRT1是PARP1的去乳酸化酶。为探究调控机制，研究人员将去乙酰化酶Sirtuin家族作为候选对象。实验表明，仅SIRT1的表达能显著降低PARP1的乳酸化程度。体外实验进一步证实SIRT1具备去乳酸化活性。进一步研究发现，无论上调还是下调SIRT1的表达水平，5KR突变体的乳酸化水平始终处于低位，这证明SIRT1是能够特异性催化PARP1去乳酸化的酶。

LDHA调节乳酸产生并影响PARP1乳酸化。鉴于LDHA在介导细胞内乳酸生成中的重要作用，研究人员探讨了其与PARP1乳酸化的关联。实验结果显示，过表达LDHA促进了乳酸生成并加剧了PARP1的乳酸化；相反，抑制LDHA或使用心肌特异性LDHA敲除小鼠显著减少了乳酸质量浓度并降低了PARP1乳酸化水平。研究证实，LDHA通过改变乳酸生产格局来调控PARP1的乳酸化状态。

ROS-ATM-CBP信号通路激活PARP1乳酸化。研究发现DOX或H₂O₂刺激引起的ROS积累及乳酸水平升高，能时间依赖性地促进PARP1乳酸化，而抗氧化剂Tempol可逆转此现象。作为胞内ROS信号感受器，ATM被磷酸化激活后可进而激活CBP。应用ATM抑制剂会削弱氧化应激下CBP与PARP1的互作及后续乳酸化增强。值得注意的是，在DOX刺激下，尽管存在SIRT1的表达，但CBP在促进PARP1乳酸化过程中的主导地位显著强于SIRT1。

CBP通过PARP1乳酸化-PARylation轴加剧DOX诱导的心肌损伤。研究发现，在DOX刺激下，表达无法被乳酸化的5KR突变体能显著减轻心肌细胞凋亡并恢复细胞活力，同时大幅降低了整体PARylation水平以及下游关键靶点的PARylation。过表达CBP虽在野生型中加重了促凋亡与PARylation表型，但该效应在5KR突变体中几乎被完全阻断。这体现了PARP1乳酸化与后续PARylation级联反应间的因果性。

心肌特异性CBP敲除小鼠减轻PARP1乳酸化并防止多柔比星引发的心功能障碍。研究采用CBP-cKO小鼠模型进行体内验证。结果显示，CBP-cKO小鼠在DOX处理后表现出显著恢复的射血分数（EF%）与左心室短缩率（FS%），血清心肌损伤标志物水平降低，心肌细胞截面积得以保持，且心肌中的PARP1乳酸化/PARylation与ROS水平大幅下降。此外，联合应用CBP抑制剂不但未削弱DOX的抗肿瘤效应，反而通过阻断致癌信号增加了不同癌系对化疗的敏感性。

在讨论部分，研究人员总结了本次研究的核心结论：ROS-ATM-CBP信号轴在氧化应激下被激活，进而介导了PARP1的乳酸化-PARylation级联反应，最终诱导细胞凋亡。心肌特异性敲除CBP通过抑制PARP1的过度激活成功缓解了多柔比星诱导的心功能异常。研究深刻阐明了PARP1乳酸化的诱发机制及其在细胞凋亡与心肌损伤中的病理作用，证实靶向调控PARP1的乳酸化修饰有望成为干预多柔比星心脏毒性的一条极具前景的新型治疗途径。