《Aging Cell》：Mesenchymal Stromal Cell Rejuvenation Strategies to Enhance Clinical Translation in Cell Therapy
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细胞治疗代表了现代医学中一个充满前景的前沿领域。间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）由于其伦理问题极少、免疫原性低、体内致瘤性可忽略不计，以及通过分泌抗炎和促血管生成因子介导的强大旁分泌活性，构成了一种极具价值的细胞
细胞治疗代表了现代医学中一个充满前景的前沿领域。间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）由于其伦理问题极少、免疫原性低、体内致瘤性可忽略不计，以及通过分泌抗炎和促血管生成因子介导的强大旁分泌活性，构成了一种极具价值的细胞来源。尽管具有这些优势，MSCs仍会经历快速的复制性衰老，伴随干细胞标志物和治疗潜能的逐渐丧失。在此背景下，细胞年轻化已成为恢复其原始生物学特征的关键策略。这些方法旨在调节衰老的标志；由于这些过程高度相互关联，研究人员提出了多种互补靶点。本综述旨在讨论和分析文献中报道的针对MSCs的主要年轻化策略，特别关注能够增强其功能性和转化潜力的方案。在此背景下，综述聚焦于五个关键干预类别：表观遗传修饰、代谢重编程、细胞衰老调控、端粒生物学和细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。这些策略代表了抵消细胞衰老并提升基于细胞治疗效果的基本轴心。
1 引言
1.1 细胞治疗与间充质基质细胞（MSCs）
细胞治疗已成为新的主要前沿，代表了生物技术的基石性转变，确立了现代医学治疗干预的“第三大支柱”。与常规小分子不同，细胞能够执行复杂的生物学功能并动态响应生物信号，使其成为一种优势资源。在各种干细胞类型中，MSCs尤其具有吸引力，因为它们可以通过常规手术程序获取，具有独特的生物学特性，且几乎不引发伦理问题。MSCs是存在于多种组织（包括骨髓、脂肪组织、肌肉、外周血以及围产期组织）中的多能细胞，能够分化为骨、软骨和脂肪等多种谱系。MSCs的特征是表达CD73、CD90和CD105，且缺乏造血标志物。它们展现出良好的前景，并重塑了组织修复与再生以及抗肿瘤策略的临床格局。MSCs的一个关键优势是其向受损组织的归巢能力，这可以是系统性的或非系统性的。非系统性归巢是指直接局部移植到特定受损部位，而系统性归巢是指由受损组织释放的归巢促进因子引导MSCs从外周循环主动迁移至靶部位。归巢在临床应用中特别受关注，因为MSCs通过短暂相互作用和旁分泌信号持续修复受损组织，而非依赖长期植入，即所谓的“打了就走”机制。MSCs也可以从围产期组织中分离，这些组织在出生后通常作为医疗废物丢弃。特别是脐带、羊水和胎膜代表了丰富且易于获取的干细胞来源。从这些组织中回收MSCs为未来治疗应用提供了实用且伦理上简便的MSCs来源。围产期干细胞因其免疫调节特性和固有的免疫特权特征而特别具有吸引力。事实上，它们极低的HLA II类分子表达允许在同种异体移植中使用，即使没有完全的供体-受体配型，从而促进了临床应用并支持了“现成”治疗产品的开发。此外，MSCs（包括从围产期组织分离的MSCs）与多能干细胞相比，形成畸胎瘤的风险显著降低，进一步增强了其临床转化的安全性和适用性。尽管有这些优势，一些挑战仍然限制了基于MSC治疗的临床转化。其中，细胞衰老是一个主要问题；然而，培养诱导的复制性衰老和体内与衰老相关的衰老应被视为不同的、尽管部分重叠的过程。前者主要源于重复群体倍增和体外扩增期间与制造相关的应激，而后者反映了供体年龄、组织特异性微环境改变、慢性炎症以及体内发生的代谢或氧化应激。这一区分具有临床相关性，因为供体相关衰老和培养诱导的衰老都可能独立影响MSC的效能、批次一致性、分化潜能、免疫调节活性和治疗效果。此外，MSCs具有显著的异质性，与供体变异性、组织来源和制造条件有关，这可能影响其功能特性、对衰老的敏感性以及对年轻化策略的响应性。随着MSCs在再生医学中的作用日益重要，克服这些限制是扩大其临床应用的基本目标。为了抵消培养细胞渐进性的功能衰退并保留表观遗传调控和转录活性，研究人员正在研究不同的方法，以在不损害谱系身份的情况下恢复细胞功能。在此背景下，“年轻化”一词被广义地解释，包括逆转已确立的衰老相关特征、延迟体外扩增期间的衰老发作，或恢复关键的MSC功能（即使没有完全逆转衰老）。因此，MSC年轻化不一定意味着完全恢复到发育年轻状态，而是可测量的治疗相关特性的改善，包括增殖、克隆形成能力、分化潜能、免疫调节活性、线粒体功能和分泌谱。
2 MSC异质性与转化意义
MSC异质性是临床转化的一个主要挑战，因为MSCs不能被视作均匀的治疗产品。其表型和功能效能受供体相关因素（包括年龄、性别、体重指数和健康状况）以及组织来源、分离程序、培养条件和传代次数的影响。这个问题对于围产期MSCs尤其相关，它们虽然具有源自发育年轻组织的优势，但仍表现出相当大的供体和来源依赖性异质性。尽管国际细胞治疗学会（ISCT）最低标准对于MSC鉴定仍然至关重要，但基于塑料 adherence、CD105、CD73和CD90的表达、缺乏造血标志物以及三系分化能力，这些参数不足以预测治疗效果或对年轻化策略的响应性。因此，MSC表征应超越身份标志物，纳入作用机制相关的功能效能量分析，这对于支持批次可比性、放行标准和临床转化期间的监管评估至关重要。在此背景下，衰老不仅是一个生物学限制，也是一个制造和产品质量问题。在体外扩增过程中，MSCs可能逐渐失去增殖能力、克隆形成能力、分化潜能和免疫调节功能。然而，衰老的发生和严重程度在供体和培养方案之间可能存在显著差异，表明传代次数本身不应被视为细胞年龄的充分替代指标。供体健康状况也高度相关，因为代谢应激可以独立于实际年龄加速MSC衰老。例如，肥胖已被证明可在年轻小鼠的骨髓、皮下脂肪组织和内脏脂肪组织来源的MSCs中诱导衰老，这支持了病理代谢状况即使在年轻供体中也可能损害MSC适应性的概念。这些方面对于GMP合规生产尤为重要。临床级MSC生产需要标准化的供体筛选、受控的分离和扩增方案、合格的试剂、经过验证的冷冻保存程序以及预定义的放行标准，包括身份、纯度、活力、无菌性、基因组稳定性和效能。大规模MSC制造还因MSC培养物的内在异质性和过程相关变异性而变得复杂，这可能影响重现性和产品可比性。
3 年轻化与衰老
衰老是健康细胞逐渐失去功能、经历永久性细胞周期阻滞并获得独特分泌表型的动态过程。在MSCs中，衰老表现为“炒蛋”形态，CD105和CD90等标志物下调，CD264和CD26上调。衰老细胞向促炎表型转变，参与炎性衰老。在分子水平上，衰老细胞可通过多种特征识别，包括形态改变、细胞周期抑制剂（p53、p21、p16）上调、视网膜母细胞瘤蛋白通路改变、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加、端粒缩短和脂褐素积累。衰老细胞最初由Hayflick和Moorhead于1961年发现，尽管存在通过衰老相关分泌表型（SASP）产生的促凋亡微环境，它们仍能抵抗凋亡。这种分泌谱包括促炎细胞因子（IL-6、IL-8）、趋化因子和蛋白酶，可通过旁分泌相互作用诱导邻近细胞衰老和整体组织损伤。衰老细胞的存活由衰老细胞抗凋亡通路（SCAPs）的上调确保。关于MSCs的相关研究表明，可以使用年轻化药物调节该细胞类型的衰老。特别是，衰老溶解药物诱导衰老细胞凋亡，而衰老调节策略旨在调节SASP和炎症，恢复组织功能。细胞年轻化旨在恢复细胞的生物学状态，减缓其功能衰退并逆转衰老的分子标志。在理解细胞衰老和操纵衰老过程方面，Yamanaka因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc——OSKM）的使用和基因编辑技术的改进代表了重要里程碑。事实上，细胞重编程策略解决了衰老过程的基础机制，如基因组不稳定性、表观遗传修饰、端粒损耗和线粒体代谢改变，这些都是细胞生理上发生的。
3.1 表观遗传修饰
表观遗传修饰通过不同的衰老相关层面靶向细胞年轻化：组蛋白变体及其修饰、DNA甲基化时钟、核小体重塑以及转录特征或非编码RNA谱的改变。
3.1.1 部分重编程
部分重编程能够实现染色质重塑和许多衰老标志的逆转，同时保留原始细胞谱系及其功能。该策略基于OSKM因子的瞬时和周期性表达，激活表观遗传年轻化程序，而不会导致完全重编程特有的完全去分化。通过这些受控周期，部分重编程可以通过增强DNA修复机制和重建更类似于年轻细胞的表达谱来改善衰老细胞的功能。部分重编程需要极其精确的基因表达周期控制，因为不受调控的激活可能导致去分化和潜在的肿瘤。文献中描述的递送系统包括可调节的腺病毒和诱导型慢病毒平台，允许受控表达OSKM。相比之下，专门针对MSCs的研究主要依赖仙台病毒载体，提供无基因组整合的瞬时重编程。尽管病毒载体保持高效率，但由于潜在的免疫原性和脱靶效应，它们对体内应用构成重大风险。可诱导系统如Tet-On/Tet-Off启动子改善了时间控制，但并未完全消除这些风险。因此，研究人员正在研究纳米颗粒和脂质体，尽管它们穿透生物屏障的能力有限。
3.1.2 小分子
表观遗传修饰可以调节染色质可及性和随后的基因表达，影响分化能力和干性基因的重新激活。这些机制包括DNA甲基转移酶催化的DNA甲基化、组蛋白修饰（如乙酰化、甲基化、泛素化和其他翻译后修饰）、ATP依赖性染色质重塑以及ncRNA介导的调控。“表观遗传药物”可以通过细胞年轻化调节表观遗传机器的酶，增加其临床应用。在这一类别中，可以提到DNA甲基转移酶抑制剂（如5-氮杂胞苷（AzaC）和5-aza-2′-deoxycytidine（AzadC））、抑制乙酰化染色质转录延伸的溴域和额外末端抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂以及组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂（如丙戊酸（VPA））。在体外，AzadC和HDAC抑制剂等表观遗传药物可以调节MSCs的免疫调节特性并影响其分化潜能。AzadC显著增加骨髓MSCs（BM-MSCs）和脂肪组织MSCs（ASC-MSCs）中HLA-G1和HLA-G3的表达，表明去甲基化在调节HLA-G表达中的作用，增加了移植后的耐受性。单独使用AzaC不足以诱导稳定的重编程：在沃顿胶MSCs（WJ-MSCs）中，关键多能性基因的表达实际上仅瞬时增加，并在72小时内自发回归。相比之下，在老年供体的ASC-MSCs中，AzaC治疗显示出显著效果：增殖率增加、对活性氧（ROS）的抵抗力增强、衰老细胞减少以及抗凋亡能力 superior，这些效果与细胞年轻化策略的潜在应用一致。AzaC对来自不同组织来源的MSCs的不同作用可通过不同的表观遗传谱以及内在的供体依赖性变异性来解释，这可能影响对该去甲基化药物的响应性。VPA则对来自脐带不同区域的MSCs表现出剂量和背景依赖性效应。在脐带MSCs（UC-MSCs）中，VPA已用于通过激活ERK和AKT通路促进向肝细胞的分化，并且用2 mM VPA预处理已显示可增强蛋白质合成和细胞重塑，将分泌组转向更神经营养的谱。在脐带血MSCs（CB-MSCs）中，短期暴露于低剂量VPA（<5 mM，3小时）增加迁移能力并增强向肌原性、软骨原性和成骨谱系的分化。在WJ-MSCs中，VPA根据剂量和培养基不同差异调节多能性或神经定向。总体而言，VPA是一种多功能表观遗传调节剂，能够增强干性、迁移或谱系规范，其效果受组织来源和培养条件的强烈影响。这种明显的二分法可以用VPA作为HDAC抑制剂的作用机制来解释，它导致染色质可及性的非特异性增加，从而根据细胞背景、剂量和暴露时间激活各种转录程序。
3.1.3 基因编辑方法
CRISPR可用于理解基因（p16INK4a或p53通路）在衰老中的作用并沉默它们，通过延迟或逆转目标组织中的衰老效应，这得益于组织特异性启动子的使用。CRISPRa和CRISPR-KO筛选在MSCs中鉴定出SOX5作为一种年轻化因子，能够激活HMGB2并减少衰老，以及H2AZ1作为一种促衰老组蛋白变体，其缺失通过pleiotrophin的去抑制恢复增殖和年轻标志物。这些研究证明了CRISPR如何能够系统绘制调节MSCs衰老命运的网络。CRISPR技术可用于上调增强细胞弹性、修复线粒体DNA突变、介导双链断裂修复或碱基切除修复的基因。在此背景下，CRISPR-Cas9可通过激活端粒和增强对氧化应激及炎症环境的弹性来提高MSCs在再生医学中的效力，特别是在炎症性疾病或年龄相关疾病中。最近的研究表明，MSCs的工程化可以产生抗衰老间充质祖细胞。Gorbunova和Seluanov证明，通过突变两个关键磷酸化位点对FOXO3进行遗传修饰，可产生抗衰老细胞（SRCs），能够抵抗衰老、氧化应激和恶性转化。在临床前试验中，通过全身输注将这些细胞用于黑猩猩，报告称SRCs是安全的、非免疫原性的和非致瘤性的，能够减少组织衰老和生物年龄，并消退炎症、氧化应激和DNA损伤。这些效应似乎由SRCs产生的外泌体介导，能够恢复细胞稳态。然而，必须承认CRISPR技术仍面临可能的脱靶修饰、递送困难、需要专门设施和专业知识、高成本以及与种系传递相关的重大遗传风险。
3.2 端粒
端粒是染色体末端的保护性结构，由TTAGGG重复序列和相关蛋白组成，细胞分裂过程中的缩短可作为衰老的生物标志物。端粒长度受端粒酶调节，端粒酶在祖细胞和干细胞中活跃，但在分化后下调，导致干细胞库耗竭和组织衰老。临界缩短的端粒诱导基因组不稳定性，导致衰老或凋亡。氧化应激和炎症加速端粒损耗：线粒体功能障碍增加ROS产生，优先损伤富含G的端粒序列并放大缩短。MSCs为研究端粒动力学及其对细胞衰老的影响提供了重要模型。胎儿MSCs在不同程度上保留端粒酶活性（取决于组织来源），但它们在培养中仍会经历衰老，导致功能降低和炎症增加。为了克服MSCs有限的增殖能力，研究人员探索了几种基于端粒酶的策略。外源性TERT单独使用可增强存活，但不足以完全永生化MSCs。TERT与病毒癌基因（如HPV E6/E7）共转导可实现长期扩增，但存在基因组不稳定的风险。体外非病毒方法结合TERT过表达和p53沉默，促进稳定增殖。此外，TERT和VEGF的双表达不仅延长了复制寿命，还增强了MSCs的血管生成潜能。此外，研究人员已在体外测试了使用抗氧化化合物来提高MSCs的增殖和端粒酶活性。开心果绿果皮提取物通过降低衰老率增加BM-MSCs的细胞活力。同样，L-肉碱在ASC-MSCs中改变hTERT启动子的甲基化状态，减少细胞衰老；姜黄素在小鼠ASC-MSCs中增加TERT表达。抗氧化和抗炎药物对端粒损耗的作用也在体内得到了很好的研究，表明维生素C、维生素E、白藜芦醇和亚精胺可以减轻氧化损伤、减少慢性炎症，并最终减缓端粒缩短。另一项体内研究进一步支持了基于端粒酶的年轻化的潜力：使用腺相关病毒介导的TERT基因疗法来对抗系统性衰老已获得批准（NCT04133649）。
3.3 代谢年轻化
ROS是晚期衰老的标志，同时伴随mtDNA突变的积累，这是ROS诱导损伤和线粒体内缺乏有效DNA修复机制的结果。氧化磷酸化（OXPHOS）系统的缺陷损害生长因子的产生，从而损害干细胞自我更新和命运决定。基于抗氧化剂的方案可以改善培养条件，保护细胞功能，并延迟复制性和应激诱导的衰老发作。在这方面，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和萝卜硫素联合处理已显示可对抗人羊水干细胞中的体外氧化应激，减少ROS积累，增加GSH水平，增强内源性抗氧化防御，同时维持OCT4和NANOG表达并调节衰老相关标志物。骨化三醇（维生素D的活性形式，1α,25(OH)2D3）处理已显示可增加BM-MSCs的细胞增殖。骨化三醇通过下调p16/Rb和p53/p21通路减少氧化应激和DNA损伤，发挥抗衰老作用。此外，它还负向调节p16/p19信号并减弱SASP。尽管已经认识到涉及代谢和炎症信号的其他机制，许多抗氧化和年轻化化合物汇聚于SIRT1相关通路。SIRT1信号通路通过有助于保护MSCs免受氧化应激、DNA损伤、凋亡和炎症刺激，参与衰老和MSCs的功能。维生素D主要通过SIRT1信号调节BM-MSCs中的干性和成骨定向。具体而言，它促进多能性标志物Nanog和Sox2的表达，支持自我更新和多谱系潜能。相反，维生素D对细胞增殖和衰老的影响在很大程度上是SIRT1非依赖性的，主要与氧化应激和DNA损伤的减少有关。在抗氧化剂中，白藜芦醇（一种多酚类植物抗毒素）以其延缓细胞衰老的能力而闻名。白藜芦醇在高度炎症环境中显示出显著效果，可恢复炎症牙周韧带来源的MSCs的成骨和细胞外基质标志物。在此背景下，激素asprosin已被证明可调节细胞代谢，促进衰老过程。补充其重组形式可赋予MSCs功能年轻化，导致增殖和迁移能力增强、衰老相关细胞周期阻滞减少以及DNA修复改善。这些效应通过H3K18乳酸化依赖糖酵解的重塑介导。另一种年轻化策略涉及通过烟酰胺单核苷酸（NMN）增强DNA修复能力，NMN是NAD+的直接前体，也是DNA修复酶（包括sirtuins）的辅助因子。MSCs的体外扩增以NAD+水平降低、SIRT1和SIRT3功能减弱以及随之而来的氧化应激和衰老增加为特征。补充细胞内NAD+水平可恢复MSCs中的线粒体适应性和自噬/线粒体自噬。此外，白藜芦醇（SIRT1激活剂）和AzaC联合处理可上调线粒体质量控制蛋白（如PINK1和Parkin），增强线粒体自噬，有助于MSC年轻化。值得注意的是，高水平的ROS作为调节分化途径的细胞内信使。因此，必须优化分化方案，将氧化应激保持在生理范围内。在围产期背景下，据报道维生素C可增强羊水干细胞（AF-SCs）的心脏分化，而芝麻素促进AF-SCs的软骨分化。
3.4 衰老的调控
细胞衰老的调控代表了恢复组织稳态、对抗机体衰老和减少慢性炎症的关键策略。在此背景下，控制MSCs中的衰老尤为重要，因为这些细胞在骨、软骨和脂肪组织的组织维持和再生中发挥关键作用。如第3节所述，衰老细胞的特征是获得SASP，通过旁分泌机制促进炎症，并通过自分泌机制强化衰老过程，同时SCAPs增加。这些特征使衰老细胞成为重要的治疗靶点。研究人员开发了两大类靶向衰老细胞的衰老治疗策略。
3.4.1 衰老溶解疗法
衰老溶解药物通过靶向抗存活机制（包括SCAPs）选择性诱导衰老细胞凋亡。这些通路中的关键调节因子包括BCL-2/BCL-XL家族成员、PI3K/AKT信号和ephrin介导的存活网络。计算机研究已确定可被衰老溶解药物靶向的几个关键通路。使用siRNA的进一步分析验证了靶向SCAPs的效果，旨在减少SASP。达沙替尼是一种被批准用于肿瘤适应症的酪氨酸激酶抑制剂，已被证明可有效清除人类衰老的脂肪细胞祖细胞。它通过依赖受体（包括ephrins）介导的凋亡发挥作用，解决衰老的关键信号通路。达沙替尼与槲皮素（一种天然黄酮类化合物；D+Q）联合使用被发现特别有效，因为它解决了SCAP网络的几个关键节点，有助于消除比单独使用任一药物更广泛的衰老细胞范围。D+Q降低SA-β-gal活性，显著改善其增殖能力，并恢复细胞骨架完整性。最近的一项应用涉及用这两种药物联合处理子痫前期（PE）患者的UC-MSCs，显示出有希望的结果。在体内，老年免疫缺陷小鼠中全身给予D+Q可将新矿化骨的形成恢复到与年轻小鼠相当的水平。此外，该组合显示出强大的临床潜力，目前正在针对几种年龄相关疾病的I/II期试验中进行评估：特发性肺纤维化、糖尿病肾病、阿尔茨海默病、骨质疏松症和虚弱。单独槲皮素也被研究用于通过抑制PI3K、各种其他激酶和serpins来对抗BM-MSCs的衰老和功能衰退。槲皮素的类似物是非瑟酮，一种在各种水果和蔬菜中发现的天然生物活性黄酮类化合物，已被确定为衰老溶解药物。与槲皮素一样，非瑟酮已证明可选择性降低衰老的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的活力，并且最近证明可在培养扩增过程中减弱ASC-MSCs的衰老。与血管紧张素受体II阻滞剂氯沙坦联合使用，也显示出在BM-MSCs中的显著抗炎和抗氧化活性，有助于其年轻化。
3.4.2 衰老调节疗法
使用诱导衰老细胞凋亡的疗法并不总是合适的，特别是在衰老细胞在组织重塑、伤口愈合和免疫监视中发挥有益作用的生理背景下。在这种情况下，衰老调节策略更受青睐，因为它们旨在保留这些功能，同时限制有害影响。衰老调节策略通过调节衰老表型而不消除衰老细胞来发挥作用。它们减弱SASP诱导的炎症，并通过增强衰老组织的再生能力来恢复组织功能。SASP的组成随时间演变。早期衰老与促纤维化和免疫调节因子相关，包括TGF-β、VEGF和细胞外基质成分，支持组织重塑。相反，慢性衰老以促炎细胞因子和蛋白酶为主，导致组织功能障碍。这种时间异质性表明，衰老调节干预应考虑衰老发作的时间以最大化治疗效果。因此，治疗策略应旨在选择性调节而非完全抑制SASP。例如，靶向关键炎症介质（如IL-1β、IL-6和基质金属蛋白酶）允许保留再生信号，同时限制病理性炎症。在分子水平上，SASP产生受应激反应信号通路和转录因子（包括NF-κB、C/EBPβ、mTOR、JAK/STAT和p38 MAPK）的严密调节。在衰老调节药物中，雷帕霉素（RAPA）是一种免疫抑制性抗生素，通过抑制Akt/mTOR通路、减少ROS产生和调节Oct-4和Nanog等多能性相关基因来调控细胞衰老。在衰老的UC-MSCs中，RAPA处理在体外和体内恢复了血管生成潜能。具体而言，它减少了衰老标志物（SA-β-gal阳性和p53表达），同时部分恢复了MSC表型和功能。当移植到肢体缺血小鼠模型中时，RAPA处理的衰老MSCs显著改善了新血管形成，并在约50%的病例中挽救了肢体，血管密度（CD31+血管）与健康对照组相当。这些发现，连同RAPA在胎盘来源的MSCs中可调节IL-6和IL-8并通过mTOR抑制减少衰老标志物的证据，表明RAPA可以在功能上使衰老MSCs年轻化并增强其治疗效果。SASP表达的一个核心调节因子是NF-κB通路，它驱动促炎细胞因子的转录，强化衰老状态。IL-1α在衰老MSCs中作为该轴的上游激活剂，促进NF-κB激活和随后的IL-6和IL-8分泌。抑制IL-1α或NF-κB代表了一种典型的衰老调节策略。在肌肉来源的干细胞/祖细胞（MSC样群体）中，使用NF-κB抑制剂对老年小鼠细胞具有年轻化作用，恢复分化潜能和应激抵抗。另一类重要的衰老调节药物包括JAK抑制剂（ruxolitinib和baricitinib），它们抑制SASP细胞因子的炎症信号。在临床前模型和早期临床研究中，JAK抑制已显示可减少系统性炎症，改善造血功能，并恢复老年器官的组织稳态。最后，多酚等天然化合物表现出剂量依赖性的衰老治疗效果。在低浓度下，它们通过减少氧化应激、防止衰老发作和调节SASP相关信号发挥衰老调节作用，在某些情况下有助于部分逆转衰老表型。相反，在较高浓度下，它们可增加细胞内ROS水平并诱导凋亡，从而发挥衰老溶解活性。总之，这些通路形成了一个高度相互关联的网络，而不是孤立的过程。
3.5 细胞外囊泡
MSCs也通过其分泌组发挥其有益作用，分泌组由生长因子、细胞因子、趋化因子、激素和细胞外囊泡（EVs）组成。EVs是细胞释放的异质性、脂质双层包裹的颗粒，大小范围从纳米到微米。它们可能起源于内体区室或直接从质膜出芽，并携带生物活性分子，包括蛋白质、脂质和核酸。MSCs分泌的EVs再现了来源细胞的许多生物学功能，如释放抗炎、迁移和血管生成因子，导致其在年龄相关的炎症和退行性疾病中的研究。与活细胞相比，EVs具有许多优势：它们被认为更安全，因为它们无法复制；它们表现出低免疫原性和高生物相容性。此外，EVs可以长期储存，生产成本相对较低，并且可以通过多种途径给药。EVs通过质膜融合、内吞内化后释放货物以及激活细胞内信号通路的受体-配体相互作用与靶细胞相互作用。值得注意的是，在体外，年轻MSCs来源的EVs已显示可通过恢复氧化还原平衡来抵消成年MSCs的年龄相关功能障碍，并最终通过转移抗氧化miRNAs、mRNAs和蛋白质限制细胞衰老。此外，UC-MSC-EVs可以通过将增殖细胞核抗原（PCNA）转移至成年BM-MSCs来促进细胞周期再进入，从而增强增殖、端粒长度维持、伤口愈合能力和血管生成。除了年轻化，MSC来源的EVs也已成为潜在的衰老治疗剂，因为它们能够减弱SASP，部分通过IL-6RA/STAT3信号轴的正常化，如用羊膜-EVs在MIN6细胞上所证明的。早期临床研究报告了EV-BM-MSCs在阿尔茨海默病等病症中的潜在益处，在认知表现和脑容量方面有适度改善。目前在ClinicalTrials.gov上注册了约50项使用“间充质干细胞来源的细胞外囊泡”搜索词的临床试验。来自临床前研究和早期临床试验的新兴证据表明，MSC来源的细胞外囊泡在多种病理条件下发挥治疗作用，包括COVID-19、呼吸道炎症性疾病、心肌损伤、脊髓损伤和皮肤再生。然而，一些临床研究未显示与安慰剂相比的显著益处，这凸显了需要进一步研究以确认其疗效并更好地定义其治疗应用。MSC来源的EVs疗法的临床转化仍面临若干挑战，包括遗传不稳定性、在恶劣微环境中效力降低、由于细胞形态改变和增殖率下降导致的大规模生产困难、半衰期短，以及阻碍其治疗潜力的培养条件。此外，由于供体特征（Zhou, Yuan等）以及分离组织的变异性，囊泡的异质性阻碍了标准化。在各种转化EVs应用的挑战中，需要提及缺乏分离和纯化的标准化方法。含有EVs的2D细胞上清收集系统增加了污染风险，并且超速离心除了是一个开放系统外，还引入了额外的步骤，缺乏可扩展性且耗时。因此，目前首选自动3D封闭系统来收集EVs，因为它们更具可扩展性、成本效益和时间效率，同时提供更高的细胞活力，并且可满足cGMP无菌要求的可扩展模型。
4 结论
为了提高基于细胞的治疗在体内应用的转化潜力，拥有高质量、可扩增的细胞作为起始材料至关重要。抵消培养诱导的复制性衰老（不同于供体和疾病相关衰老）可以保留MSC的增殖、克隆形成能力、分化、免疫调节活性和分泌谱。这也是一个制造优先事项，因为供体特征、组织来源和培养条件会影响效能、批次可比性和产品一致性。因此，年轻化不应被视为完全恢复到年轻状态，而是恢复治疗相关功能而不丧失谱系身份。此外，研究年轻化疗法可以深入了解衰老的分子机制，阐明稳态的关键调节通路。然而，现有方法在作用机制、实验控制程度和安全概况方面存在显著差异。尽管临床前研究结果令人鼓舞，但与基因组稳定性、致瘤性、递送以及供体和方案间变异性相关的问题继续限制所选策略（特别是涉及遗传操作的策略）的临床转化。年轻化技术可能与广泛的病理环境相关，包括组织再生、糖尿病、骨退化、神经退行性和心血管疾病、慢性肺病和肾病、纤维化、自身免疫和炎症性疾病以及癌症。然而，有希望的临床前发现和一致的临床结果之间的差距仍然很大。未来的研究应集中于几个关键领域：首先，采用统一标准来定义MSC年轻化，超越增殖增加，整合细胞身份、衰老相关标志物、基因组稳定性、线粒体功能、分泌组组成和疾病相关功能活动；其次，在不同MSC来源、供体特征和培养条件下系统比较年轻化方法；第三，开发基于作用机制的效能量分析，以支持批次可比性和产品放行；最后，评估长期安全性，包括基因组稳定性、致瘤性、持久性以及移植后的功能行为。未来的研究不应确定一种普遍最优的年轻化策略，而应确定哪些干预措施最适合特定的MSC来源、制造平台和治疗适应症。从这个角度来看，整合标准化的GMP兼容工作流程与强大的体外和体内验证对于确定年轻化诱导的功能改善是否持久、可重复和具有临床意义至关重要。这种适应症特异性和产品导向的方法可能有助于弥合MSC衰老研究中的机制进展与可靠的基于MSC的治疗产品开发之间的差距。
