通过整合最小侵入性采样和环境DNA（eDNA）增强爱尔兰水域宽吻海豚（Tursiops truncatus）的种内群体遗传学研究

《Ecology and Evolution》：Enhancing Intra-Specific Population Genetic Studies of Bottlenose Dolphins (Tursiops truncatus) in Irish Waters by Integrating Least Invasive Sampling and Environmental DNA (eDNA)

　　

群体遗传学为基于证据的海洋哺乳动物物种保护与管理提供了重要数据。获取海洋哺乳动物的组织和遗传物质具有挑战性，常常导致样本量有限，然而新兴的最小侵入性采样方法，如生物体外DNA（例如，喷气孔分泌物）和环境DNA（eDNA）（例如，水），有可能为种内遗传研究提供额外样本。因此，本研究旨在通过将直接方法（例如，自由放养海豚的活组织检查和死亡海豚的组织）获取的样本（n=67）与使用最小侵入性间接方法（从水中分离的eDNA，或从喷气孔分泌物、粪便和脱落的皮肤中收集的生物体外DNA，这些样本在个体附近机会性地采集）收集的样本（n=52）进行相互验证，进一步调查爱尔兰宽吻海豚（Tursiops truncatus）的群体遗传结构。使用15个微卫星标记、线粒体DNA（mtDNA）控制区的一段540bp片段和核性别标记，研究人员从间接方法获取的样本中获得了种内遗传信息，包括从11个样本（21%成功率）中恢复的已知mtDNA单倍型，以及来自15个标记中5个的一致微卫星基因型，这些信息足以将个体分配至其起源群体。这项工作产生了迄今为止最全面的爱尔兰宽吻海豚群体遗传学研究（140个个体），确认了三个遗传上截然不同的群体的存在，即一个外海生态型和两个沿海定居群体（香农河口和康尼马拉-梅奥-多尼戈尔群体）。重要的是，研究结果提供了确凿证据，表明香农海豚使用布兰登湾（凯里郡）作为关键觅食区，该区域位于当前香农河下游特别保护区（SAC）边界之外，因此主张修订这些边界。此外，本研究还包括了来自爱尔兰若干“独居”海豚的样本，这些海豚在遗传上被分配至外海生态型，进一步展示了最小侵入性采样方法（包括eDNA）作为研究种内遗传变异的有前景工具。

**研究背景与问题**
宽吻海豚（*Tursiops truncatus*）是爱尔兰沿海和外海水域常年出现的顶级捕食者，也是生态系统对气候变异和人为干扰响应的哨兵物种。欧盟栖息地指令要求为这些海豚提供严格保护，并指定特别保护区（SAC）覆盖其代表性栖息地。目前，爱尔兰已设立两个沿海SAC（香农河下游SAC和西康诺特海岸SAC）以及三个外海SAC（波丘派恩堤岸峡谷SAC等），分别保护遗传上不同的群体。然而，此前的研究（如Mirimin等，2011）虽揭示了三个遗传上不同的群体（一个外海生态型和两个沿海定居群体），但样本量有限，且来自偏远或采样困难区域（如外海水域）的样本代表性不足。此外，关于独居社交海豚的起源群体尚不清楚，同时香农河下游SAC边界是否足以保护香农群体也缺乏确凿证据。因此，需要扩大样本数量和范围，并探索最小侵入性采样方法（如环境DNA（eDNA））以获取种内遗传信息，从而更全面地理解群体结构，为管理决策提供依据。

**研究内容与结论**
本研究通过整合直接方法（活组织检查和死亡海豚组织，n=67）与最小侵入性间接方法（水样eDNA、喷气孔分泌物、粪便和脱落皮肤，n=52）的样本，利用15个微卫星标记、线粒体DNA（mtDNA）控制区序列和核性别标记，对爱尔兰宽吻海豚进行了迄今最全面的群体遗传学分析（共140个个体）。结果表明，存在三个遗传上截然不同的群体：外海生态型、香农河口沿海群体和康尼马拉-梅奥-多尼戈尔沿海群体。此外，布兰登湾（凯里郡）的样本（包括活组织检查和eDNA）均匹配香农群体的mtDNA单倍型，表明该区域是香农群体的关键觅食区，但位于香农河下游SAC边界之外，因此建议修订边界。独居社交海豚（如Dusty、Fin、Nimmo和Nick）被分配至外海生态型，而Fungie显示中间基因型（香农/外海），且性别偏向雄性，提示雄性可能更易成为独居个体。该研究证明了最小侵入性采样方法（包括eDNA）在获取种内遗传数据方面的潜力，并为爱尔兰宽吻海豚的保护管理提供了重要证据。论文发表在《Ecology and Evolution》。

**关键技术方法**
研究人员使用了以下主要技术方法：样本来源包括爱尔兰沿海2000-2021年间的搁浅组织（n=48）、2011-2014年期间使用Barnett十字弓采集的自由放养海豚活组织检查样本（n=19），以及2021年7月从“Celtic Mist”号研究船和独居海豚附近机会性采集的最小侵入性样本（共52份，包括26份海水eDNA、9份喷气孔分泌物、2份粪便、2份脱落皮肤和1份潜水服拭子）。DNA提取采用改良的DNeasy Blood & Tissue试剂盒（QIAGEN）。分子性别鉴定基于ZFX和SRY基因。核微卫星基因分型使用15个位点（与Mirimin等2011年研究相同），通过毛细管电泳分型，并采用严格的质量控制（如重复运行、去除假等位基因）。mtDNA测序针对控制区540bp片段，使用Sanger测序，并与已知单倍型比对。群体结构分析使用STRUCTURE软件（无先验信息）、AMOVA和成对F_ST估算。

**研究结果**
- **3.1 DNA产量与标记可用性**：不同样本类型间DNA产量差异显著，组织样本mtDNA测序成功率为100%（活组织检查）和90%（搁浅），而eDNA海水样本仅为16%。性别鉴定成功率和微卫星基因分型成功率同样以组织样本最高，最小侵入性样本较低但可获得可用数据。通过重复运行估算的基因分型错误率分别为1.3%（组织）和2.7%（最小侵入性样本）。所有最小侵入性样本中，粪便和脱落皮肤的表现优于海水eDNA样本。
- **3.2 核微卫星标记基因分型**：共129个独特个体纳入分析（包括85个来自Mirimin等2011研究和44个新个体）。STRUCTURE分析支持K=3的模型，确认三个遗传群体：外海群体（主要由搁浅海豚和独居海豚样本组成）、香农群体（包括香农河口70km范围内活组织检查、搁浅和eDNA样本）以及西北沿海群体（康尼马拉-梅奥-多尼戈尔）。独居海豚Dusty、Fin和Nimmo被分配至外海群体，Fungie显示中间基因型。成对F_ST值（0.085-0.166）均显著（p<0.001），表明群体间高度分化。
- **3.3 mtDNA测序结果**：52份最小侵入性样本中，11份（21%）获得了与宽吻海豚匹配的mtDNA序列，其中9份质量足够匹配已知单倍型。共鉴定出15个单倍型（包括1个新单倍型Ire15）。香农群体仅含两个单倍型（Ire1和Ire2），布兰登湾的eDNA样本也匹配这些单倍型，支持该区域属于香农群体。独居海豚Dusty显示Ire2单倍型。AMOVA显示40%变异存在于群体间，60%在群体内，成对F_ST值均显著（p<0.05），与核微卫星结果一致。

**讨论总结**
本研究通过扩大样本量（包括最小侵入性样本）确认了爱尔兰宽吻海豚三个遗传群体的存在，并提供了支持香农河下游SAC边界扩展的遗传证据。讨论部分指出：最小侵入性采样（尤其是eDNA）在获取种内遗传数据方面具有潜力，但需注意样本特异性（如避免多物种扩增）和个体混合问题。未来可通过无人机（UAV）辅助采样、开发物种特异性标记或扩增子序列变异（ASV）元条形码提高效率。对于香农群体，布兰登湾作为关键觅食区的证据表明其活动范围超出当前SAC边界，需修订边界以保护该群体。西北沿海群体表现出长距离移动（覆盖爱尔兰整个海岸线及英国水域），提示需建立SAC网络和迁移廊道。独居海豚多属外海生态型且雄性居多，可能反映了雄性更易脱离群体独立生活的行为模式。

**研究结论**（翻译自原文结论部分）：
本研究为爱尔兰水域宽吻海豚提供了迄今最全面的群体遗传学分析。除了确认先前报道的3个遗传上截然不同的群体的存在（Mirimin等，2011），本研究还展示了最小侵入性采样方法（如海水eDNA）作为获取种内遗传数据的可行途径。更大的样本量使研究人员发现了一个新的mtDNA单倍型，而对布兰登湾（凯里郡）自由放养海豚的靶向采样进一步提供了支持扩大香农河下游SAC边界的证据。