恶性疟原虫PX1多态性在乌干达出现并传播及其与抗疟药敏感性降低的关联

《Nature Medicine》：Emergence and spread of Plasmodium falciparum PX1 polymorphisms associated with decreased susceptibility to antimalarials in Uganda

　　

以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）是疟疾治疗与控制的基石。在非洲，青蒿琥酯-本芴醇（AL）是最广泛使用的一线ACT，但其在乌干达的疗效正日益受到青蒿素部分耐药（ART-R）和本芴醇敏感性降低的威胁。为鉴定导致该敏感性降低的位点，研究人员评估了乌干达157例恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）全基因组序列中的选择信号。尽管在Kelch13（K13）C469Y和A675V突变周围观察到扩展单倍型，但近期最强选择信号集中于第7号染色体上编码磷酸肌醇结合蛋白PX1（PF3D7_0720700）的区段。一个由3个PX1突变（L1222P、M1701I和D1705N）及2个缺失（命名为PIN）代表的单倍型于2008年首次出现并迅速增加，至2016年在乌干达北部流行率>50%，2023年在东部>50%。携带PIN的寄生虫对 Ded 本芴醇、甲氟喹和双氢青蒿素（青蒿琥酯活性代谢物）的离体（ex vivo）敏感性显著降低。体外（in vitro）敲除px1的虫株对三药敏感性增加。因此，PX1多态性似乎影响非洲疟原虫对关键药物的敏感性。

研究背景与立项依据

青蒿素类联合疗法（ACTs）是控制无并发症恶性疟的核心手段，其中青蒿琥酯-本芴醇（AL）自2006年起为乌干达一线方案。东南亚已证实Kelch13（K13）突变介导青蒿素部分耐药（ART-R），而近年来乌干达北部与东部亦出现K13 C469Y与A675V突变及本芴醇离体敏感性下降；但本芴醇机制未明，已知MDR1（multidrug resistance protein 1）与CRT（chloroquine resistance transporter）变异仅带来微弱变化，经验证的本芴醇耐药遗传决定因素尚未明确。乌干达作为ART-R新兴热点，亟需通过全基因组视角识别驱动ART-R与本芴醇敏感性降低的正向选择位点。该研究发表于《Nature Medicine》，通过对乌干达虫株全基因组测序（WGS）扫描选择信号，发现并功能验证了第7号染色体px1基因PIN单倍型在多药敏感性降低中的核心作用。

主要技术方法概述

研究人员依托乌干达北部（Agago/Kalongo）与东部（Tororo）2004–2024年临床监测队列，筛选低感染复杂度（COI）、含K13突变或低本芴醇/双氢青蒿素离体IC₅₀样本及匹配野生型对照，经选择性全基因组扩增后行Illumina NovaSeq测序（n=157）；辅以Oxford Nanopore（ONT）长读长测序解析px1结构变异；采用isoRelate（iR）与集成单倍型纯合性（iHS）及扩展单倍型纯合性（EHH）进行全基因组正向选择扫描；利用线性混合效应模型校正位点、年份、K13基因型等协变量关联px1单倍型与离体药敏；并行构建3D7背景px1敲除（KO）克隆与PX1-GFP回补株，行72小时体外生长抑制实验验证功能。

研究结果

全基因组测序与乌干达虫株队列

对190例低COI样本质控后158例获≥50×覆盖，最终157例进入分析，鉴定55,100个高质量SNP（MAF≥2%）。

K13 C469Y与A675V周围的正向选择证据

EHH显示两突变均具强选择扫荡信号；单倍型聚类见C469Y单一单倍型、A675V一主两次单倍型；PCA与IBD网络未见地理或突变状态聚类，提示大量重组而非克隆扩张。

px1基因周围单倍型呈强正向选择

iR扫描在chr.7:728081–988719处获最强峰，含69基因；iHS过滤后11个非同义SNP显著，其中5个位于该区，PX1 D1705N具最高iHS与EHH。px1区重组率（ρ=0.78–1.97）远低于侧翼基因，LD衰减局限该区，支持px1为选择靶心。

以px1基因为中心的单倍型块

单倍型聚类将L1222P/M1701I/D1705N及del_{V1680–N1685}、del_N811–Y822归为共享PIN单倍型（占58.2%），野生LMD占28.5%；ONT确认外显子3内框内缺失。

px1 PIN单倍型在乌干达流行率快速上升

对1,598例（2004–2024）扩增px1 2.6 kb区段ONT分型：2004年无PIN；2008年首现；2024年东部达55%（Mann–Kendall P=0.009）、北部84%（P=0.009）。PIN出现早于K13突变（2016），且在C469Y/A675V虫株中同现率更高，但不与MDR1/CRT/叶酸通路突变共选。

px1 PIN单倍型关联双氢青蒿素与本芴醇离体敏感性降低

在reads≥25×且主等位基因≥90%的465例中，PIN较LMD野生型对双氢青蒿素（DHA）、本芴醇、甲氟喹IC₅₀显著升高（Wilcoxon P<0.001）；K13野生背景下DHA中位IC₅₀ 3.7 vs 1.8 nM，本芴醇14.3 vs 6.2 nM。混合模型显示PIN解释DHA表型方差12.3%、本芴醇4.9%，RSA存活率无差异。

体外px1缺失致本芴醇、甲氟喹、DHA IC₅₀下降

3D7来源两株独立PX1-KO克隆72小时药敏示：相对亲本，DHA IC₅₀降1.75–1.87倍（P<0.05），本芴醇降3.16–3.89倍（P<0.05），甲氟喹降3.23–3.56倍（P<0.01）；PX1-GFP回补株与3D7无差，氯喹敏感不变，证实表型归因px1功能丢失。

px1 PIN单倍型在全球Pf6库中极罕见

MalariaGEN Pf6（6,388例）中PIN仅5例（刚果金3、肯尼亚2，均为非洲邻国），2010年乌干达样本（n=13）未检出，提示其为乌干达局部新兴扩张单倍型。

讨论与结论翻译

乌干达报道的本芴醇敏感性降低与ART-R兴起促使研究人员全面搜寻方向性选择基因组区域。利用具不同K13与药敏表型的WGS虫株，研究人员定位第7号染色体px1为中心的最强近期选择信号。PIN单倍型（L1222P/M1701I/D1705N+两缺失）具最长共享侧翼单倍型，2004年前无、2008年首现、早于K13突变扩张；携PIN虫株离体对本芴醇与DHA敏感性显著降低，px1敲除则超敏，表明PX1多态性可介导AL两成分敏感性降低。选择证据链包括：iR峰中心、最高IBD分数、D1705N最强iHS/EHH、L1222P与D1705N频率时段增量最大、侧翼同义/非编码SNP搭车、px1最低重组率。PIN在北部已占绝大多数、东部速升，其时空轨迹与本芴醇敏感性北早东晚下降吻合。PX1参与血红蛋白向食物泡运输，功能类比K13内吞通路但阶段特异性不同——px1 KO在0–3小时环期生存实验（RSA）呈耐药样、在72小时生长抑制呈超敏，区别于K13。PIN与本芴醇、甲氟喹、DHA交叉低敏相关，但临床终点影响未定；离体Albumax体系游离药浓度偏高，IC₅₀由LMD约6 nM升至PIN约14 nM是否转化至治疗失败需临床试验确认。鉴于AL为撒哈拉以南最常用ACT，PIN单倍型快速扩张及其药敏关联要求将其纳入分子监测面板并开展治疗结局研究。