革兰氏阳性芽孢杆菌门中醌转运丝状伪膜拓展生物能量学容量

《Nature Microbiology》：Quinone-transporting filaments expand bioenergetic capacity in Gram-positive Bacillota

　　

细胞呼吸依赖于将电子传递给膜双层中的疏水性醌（quinone），这意味着生物能量学容量受限于可用的膜表面积。革兰氏阴性菌通过内部膜内陷扩展该容量，真核生物利用膜结合细胞器，而革兰氏阳性菌是否具有替代的容量生成机制尚不清楚。本文研究人员表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）形成一种由NADH脱氢酶Ndh与醌转运蛋白Ncp组成的醌转运伪膜（pseudomembrane）。冷冻电镜（cryo-EM）、脂质组学与分子动力学（MD）揭示，Ndh与Ncp与脂质共组装为4:4化学计量复合物，其具溶剂排阻的疏水内腔并含磷脂，可隔离醌。这些复合物进一步组装成丝状体，将腔室连接为连续管道以放大醌还原。系统发育分析提示该容量在芽孢杆菌门（Bacillota）中广泛存在。因此，醌转运丝状体揭示了在占据最小膜空间的同时拓展醌池与生物能量学容量的策略。

研究背景与立项依据

细胞呼吸的电子传递链受限于膜表面积这一“膜不动产”，革兰氏阴性菌借内膜内陷、真核生物借线粒体嵴与叶绿体类囊体扩展呼吸面，而革兰氏阳性菌仅有单层膜且需兼顾细胞壁合成、营养导入与分泌，其如何突破呼吸容量瓶颈长期未知。枯草芽孢杆菌编码三种II型NADH脱氢酶（NDH-2），其中Ndh为营养期主导酶，但其缺乏典型膜锚定残基，同源基因ndh与yjlC（后命名Ncp，含C端DUF1641结构域）共操纵子排列暗示功能偶联。研究人员据此推测Ndh与Ncp形成可溶性复合物，以非膜嵌入方式拓展醌还原位点，并在《Nature Microbiology》报道其发现。

主要技术方法概览

研究人员以枯草芽孢杆菌168野生型及Δndh、Δncp敲除株为遗传材料，于大肠杆菌中共表达N端双Strep标签Ncp与Ndh并纯化；采用负染电镜与冷冻电镜单颗粒及螺旋重构解析单体（2.11 ?）与丝状（多单元连接）结构；通过UV-可见光谱、NADH/甲萘醌（MDA）动力学测定酶活；以脂质组学定量复合物及大肠杆菌/枯草芽孢杆菌膜中磷脂与醌（UQ-8、MK-8、MK-7、DMK-8）；用分子动力学模拟PE/PG脂质与MK-7在Ndh-Ncp-双层体系中的排布；以循环伏安法在MK-7修饰磷脂电极上检测电子传递；最后基于GTDB 113104基因组筛查Ndh-Ncp分布并构建最大似然系统发育树（LG+I+R10模型，Sqr为外群）。

研究结果

Ndh来自枯草芽孢杆菌与Ncp形成功能性复合物

Δndh与Δncp株37℃与30℃生长速率及产量均下降且表型相似，提示Ncp缺失模拟Ndh缺失。纯化复合物含FAD，NADH加入产生450 nm黄素峰与660 nm电荷转移复合体（CTC）峰。以MDA为受体Km为50 μM、Vmax 110 s^?1，对癸基泛醌（DQ）活性更低，表明偏好甲基萘醌（menaquinone）。负染与冷冻电镜显示复合物组装为可达13单元的丝状结构。

Ndh与Ncp形成关联为丝状体的复合物

单体冷冻电镜解析为Ndh₄-Ncp₄具C4对称，Ncp形成中心中空四聚管（头尾口径约20 ?），支架四个Ndh；Ndh C端正电螺旋与Ncp负电区静电驱动界面。螺旋重构显示单元头尾堆叠成丝，Ncp Phe108嵌入邻单元尾腔，Lys115-Asp21盐桥稳定接口；跨种Ncp同源序列保守，定点突变削弱丝形成。从枯草芽孢杆菌原生裂解液经阴离子交换与尺寸排阻追踪NADH氧化酶活，负染电镜获同源丝状结构，证实生理条件下成丝非过表达假象。

Ndh-Ncp在保守位点结合NADH与甲基萘醌

NADH共存冷冻电镜（2.52 ?）显示FAD、NADH与MK-8位于保守位：FAD靠Lys127/Glu168/Lys373等配位；NADH靠WxxG（Trp254-Gly257）及Ile116等保守残基；醌位点AQxAxQ基序（Ala311-Gln312-Ala314-Gln316）朝向管内腔，Tyr380等配位MK-8头部，表明醌自内腔进入而非膜侧直接还原。

Ndh-Ncp复合物结合磷脂并抽取甲基萘醌

脂质组学示纯化复合物富积PE、PG及UQ-8/MK-8/DMK-8，醌/磷脂摩尔比高于大肠杆菌膜。与枯草芽孢杆菌膜孵育后复提复合物，MK-7丰度提升约90倍，MK-7/膜特有脂质峰强比高于膜本身，证明确可从原生膜抽取MK-7富集于管内。

Ndh-Ncp-磷脂复合物的架构

MD模拟置入39个PE/PG，头部靠Ndh Arg213/Lys351与Ncp Lys51/66/81/85/95/121正电残基朝外溶剂侧，酰基尾伸入疏水内腔动态分布；Ncp头Phe108稳嵌双层，Arg112/Lys115协调膜脂头部，管口穿透双层使腔内疏水连续于膜疏水核，构成醌跨膜-管扩散通道。

醌扩散驱动电子从Ndh-Ncp向膜传递

循环伏安中MK-7修饰磷脂膜上，无NADH时MK-7氧化还原峰位于+0.09 V/?0.28 V（vs SHE）；加NADH出现起始电位?0.075 V催化氧化电流，还原峰消失，电化学Km(NADH) 91.6 μM。无外加MK-7时利用复合物自带MK-8产生衰减催化流（扩散常数8.2×10^?4 s^?1），UQ-8响应极弱，印证MK选择性及管内醌池可离膜维持Ndh催化。

Ndh-Ncp复合物广布于芽孢杆菌门

GTDB全库筛查示Ndh-Ncp仅存于Bacillota，8.5% Ndh同源基因邻位连ncp，涉30科684种，多见于好氧/兼性厌氧，绝迹于严格厌氧梭菌等；所有携带株另含非Ncp偶联NDH-2。系统发育将NDH-2分A-F支，Ncp偶联Ndh独成C1支（具C端Ncp结合域与ndh-ncp共操纵），C2为过渡支（保留膜锚C端且ncp非严格共线），提示DUF1641先获入再共演化成丝伪膜，C1枝长较短系较新近创新但已广布。

讨论与结论翻译浓缩

研究人员讨论指出，革兰氏阳性菌无内膜或细胞器，却借Ndh-Ncp蛋白-脂质伪膜丝在胞质侧数百埃外构造连续疏水醌腔，功能收敛于线粒体嵴与呼吸超复合物，但机制迥异：不占膜跨膜区而借DUF1641支架+磷脂内衬实现醌池外推。该架构在Bacillota好氧谱系中保守，提示“膜不动产”限制可通过可溶性蛋白-脂质组装规避。结论重申：枯草芽孢杆菌Ndh与Ncp形成4:4复合物并进一步头尾聚合为丝状伪膜，其内腔嵌磷脂、隔离并长程转运呼吸醌，由NADH电子还原醌后将还原态醌回输膜内终端氧化酶，从而在最小膜占用下拓展醌池与生物能量学容量；此一策略在芽孢杆菌门中广泛分布，代表细菌生物能拓展的保守新机制。