《Journal of Extracellular Vesicles》：Small Extracellular Vesicle-Derived Nidogen 1 Promotes HCC Carcinogenesis via Transglutaminase 3-Mediated YAP/TAZ Signalling
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肿瘤来源的小细胞外囊泡（sEV）通过促进细胞间通讯，越来越被认为是癌症进展和转移的关键介质。在此项研究中，研究人员发现 basement membrane 糖蛋白 nidogen 1 (NID1) 在转移性肝细胞癌（HCC）细胞的 sEV 中显著富集。研究人员
肿瘤来源的小细胞外囊泡（sEV）通过促进细胞间通讯，越来越被认为是癌症进展和转移的关键介质。在此项研究中，研究人员发现 basement membrane 糖蛋白 nidogen 1 (NID1) 在转移性肝细胞癌（HCC）细胞的 sEV 中显著富集。研究人员证明，sEV 介导的 NID1 递送增强了致癌行为，包括增殖、侵袭和转移。NID1 基因敲除小鼠在 N-diethylnitrosamine (DEN) 和 carbon tetrachloride (CCl4) 或癌基因的 hydrodynamic injection delivery 诱导的肝肿瘤形成中表现出明显的延迟，强调了 NID1 在肝细胞癌发生中的作用。重要的是，研究人员发现作为肿瘤微环境特征的较硬的 extracellular matrix 会刺激 sEV 中 NID1 水平的增加。使用 NID1 突变体，研究人员确定 C-terminal domain 对其致癌功能至关重要，包括促进肿瘤生长和转移。Proteomic profiling 揭示 transglutaminase 3 (TGM3) 通过其 C-terminus 与 NID1 相互作用。随后的分析表明，sEV-NID1 提高了 TGM3 水平，导致 integrins 失调并激活 YAP/TAZ 信号通路，从而促进肿瘤进展。为了探索治疗潜力，研究人员开发了一种新型单克隆抗 NID1 抗体（anti-NID1 mAb），并在多种 HCC 小鼠模型中评估了其疗效。该抗体显著抑制了人和鼠 HCC 细胞的肝肿瘤生长和转移。当与 HCC 的标准治疗药物 sorafenib 联合使用时，治疗效果得到进一步增强。研究人员的发现描绘了一条促进肝细胞癌发生和转移的新型 sEV-NID1-TGM3 调节轴，并表明利用自制的单克隆抗体靶向 sEV 递送的 NID1 为 HCC 的治疗干预提供了一条有希望的途径。
肝细胞癌（HCC，the most common type of primary liver cancer）占肝癌病例的80%以上，由于具有无症状特征，多数患者确诊时已是晚期，5年生存率极低。在HCC中，预先存在的肝硬化是主要危险因素，这导致细胞外基质（ECM，a three-dimensional macromolecular network）交联与收缩增加，进而引起基质重塑与硬化。小细胞外囊泡（sEV，nanoscale vesicles secreted by cells）是介导细胞间通讯的重要载体。研究表明，肿瘤细胞会劫持sEV转移致癌物质来支持其生长和扩张。Nidogen 1（NID1）是基底膜的关键链接糖蛋白，其表达异常在多种癌症中与不良预后和侵袭性相关。然而，是什么触发了NID1在sEV中的富集及其下游激活机制，在很大程度上仍然未知。为了探索这一问题，研究人员开展了关于sEV-NID1在HCC发生中的机制研究，发现了一条新的sEV-NID1-TGM3调节轴，并验证了靶向NID1的治疗潜力。该研究对深入理解HCC进展机制及开发新的治疗策略具有重要意义。研究结果发表在《Journal of Extracellular Vesicles》。
在研究技术方法方面，研究人员主要利用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NID1敲除细胞系和NID1-KO小鼠。通过超速离心法分离sEV，并结合免疫印迹、透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析对sEV进行表征。研究中采用了基于不同基质硬度的细胞培养模型。在蛋白互作分析方面，应用了免疫共沉淀耦合质谱技术和分子对接分析。动物实验样本队列来源于野生型和NID1-KO小鼠，建立了多种HCC小鼠模型，包括N-diethylnitrosamine (DEN) 和 carbon tetrachloride (CCl4) 化学诱导模型、Hydrodynamic tail vein injection (HDTVi) 模型、原位肝植入模型、肺定植转移模型以及来源于Queen Mary Hospital, Hong Kong患者组织的PDX模型。
sEV介导的NID1递送有助于HCC发生
研究人员通过CRISPR/Cas9技术在转移性MHCC97L细胞中敲除NID1，并从小鼠模型中分离sEV。实验显示，接受野生型sEV的受体细胞NID1水平显著升高，而接受敲除型sEV的细胞集落形成、迁移和侵袭能力受损。在NID1-KO小鼠中，化学诱导和HDTVi模型均显示肿瘤标志物AFP水平和肿瘤结节数量显著减少。这证明sEV递送的NID1显著促进了HCC的致癌行为。
sEV-NID1升高与基质硬化有关
为研究基质硬度对sEV-NID1的影响，研究人员将HCC细胞培养在0.5 kPa（软）和8 kPa（硬）的基质上。结果发现，虽然总蛋白量和sEV形态无明显差异，但硬基质上细胞的sEV浓度更高，且sEV-NID1蛋白水平特异性升高，而细胞内NID1总量未受影响。将硬基质来源的sEV共注射到小鼠肝脏后，表现出更快的肿瘤生长和更高的NID1表达。这说明肝脏基质硬化是导致sEV-NID1高表达的原因。
C末端结构域对sEV-NID1的致癌能力至关重要
研究人员设计了去除了不同结构域的NID1突变体。体外和体内实验表明，缺失C末端671-1247区域（N677突变体）显著削弱了sEV-NID1的致癌能力，表现为集落形成、迁移和肺定植能力的下降。而回补C671片段则能恢复sEV-NID1的促肿瘤和促转移功能。这证实了C末端结构域在介导sEV-NID1致癌作用中起着核心作用。
sEV-NID1的C末端结构域在受体细胞中与TGM3相互作用
通过co-IP-MS分析，研究人员发现跨谷氨酰胺酶3（TGM3）是NID1 C末端的潜在结合蛋白。TCGA数据分析显示TGM3在HCC中上调且与预后不良相关。分子对接预测NID1的C末端区域与TGM3具有高亲和力。免疫印迹证实，受体细胞内TGM3蛋白水平的升高并非由sEV直接转移，而是由于sEV-NID1在受体细胞内通过结合作用稳定了内源性TGM3蛋白。这一发现揭示了sEV-NID1与TGM3之间的互作机制。
TGM3是sEV-NID1促进HCC侵袭性的下游激活因子
研究人员在受体细胞中敲低TGM3后，发现HCC细胞的致癌特性显著降低，且对sEV-NID1的促癌作用失去响应。体内实验证实，TGM3敲低的细胞形成的肿瘤生长缓慢。这表明TGM3是介导sEV-NID1的功能的关键下游效应因子。
TGM3丢失导致整合素失调和Hippo通路激活
分析发现，TGM3敲低的细胞外基质受体互作途径发生改变，多种整合素（integrins）表达紊乱。通路研究表明，阻断NID1或TGM3会抑制FAK-Src-Akt信号，进而激活Hippo激酶级联反应（MST1和LATS1）。这导致YAP在Ser
127位点被磷酸化并滞留在细胞质中，无法入核发挥转录共激活作用。这证实了sEV-NID1-TGM3通过调节整合素介导的Hippo-YAP/TAZ信号传导来促进肿瘤进展。
用单克隆中和抗体靶向NID1的治疗潜力
研究人员发现自制的anti-NID1 mAb能有效抑制sEV-NID1诱导的促癌效应。在多种动物模型中，包括sEV教育模型和肺定植模型，给药anti-NID1 mAb显著抑制了肿瘤生长和肺转移。更重要的是，在PDX模型和两种HDTVi模型中，anti-NID1 mAb与一线化疗药物sorafenib联合使用时，展现了最显著的协同抑癌作用，且小鼠耐受性良好。这提示靶向阻断NID1具有临床治疗潜力。
总结与讨论
研究人员的结论强化了sEV-NID1在肝细胞癌发生中的作用，并确认了C末端结构域的关键功能，指出基质硬度是促进sEV-NID1过表达的因素之一。该研究确定了TGM3是sEV-NID1的关键下游效应因子，通过介导整合素-Hippo信号传导调节来推动HCC的恶性进展。在多种动物模型中验证了使用自主研发的anti-NID1中和抗体阻断sEV-NID1的治疗概念，突出了其作为HCC治疗新策略的潜力。尽管研究初步阐明了分子机制，但关于基质硬化如何增强NID1在sEV中包装的具体机制，以及该抗体在体内抑制Hippo通路的详细机制等，仍有待进一步的研究探索。
