综述：破解细菌持留菌：从分子机制与宿主适应到新方法学及应对策略

《Science Bulletin》：Cracking bacterial persisters: from molecular mechanisms and host adaptation to novel methodologies and countermeasures

　　

持留菌代表一种表型耐受，其特征为最低抑菌浓度（MIC）值处于敏感范围内，并伴有以ATP耗竭为标志的代谢活性降低，这一特征很可能与持续性和复发性感染有关。尽管先前的研究已解决了与持留菌相关的某些问题，但缺乏从细菌生理学到宿主-病原体相互作用的最新研究进展。因此，本综述旨在阐明细菌持留的定义、区别、形成机制、宿主-病原体适应、新方法学及根除策略，同时强调与细菌持留相关的最新进展和前景。本综述试图整合现有知识，作为机制和干预研究的基础资源，并激发对抗持留菌感染的创新方法。

1. 1.
   引言
   细菌可引起人体多个部位的感染，包括呼吸道、泌尿道和血流。尽管新型抗生素的发现与广泛使用使多种细菌感染得以治疗，但细菌仍能在抗生素存在下存活。传统上，细菌对抗菌剂的存活主要归因于耐药基因和相关突变诱导的耐药性和异质性耐药，称为基因型耐药。然而，越来越多的研究表明，表型耐受也在促进细菌存活中发挥作用，包括持留和耐受，统称为顽固性（recalcitrance）。持留菌是细菌的一个亚群，以休眠或缓慢生长的代谢状态为特征，在抗生素暴露、营养剥夺和活性氧（ROS）等不利应激物下表现出显著的存活能力。革兰阴性菌（GNB）和革兰阳性菌（GPB），如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）等，是导致一系列高发病率和高死亡率细菌感染的主要病原体。随着抗菌药物的广泛使用和滥用，抗菌素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的焦点，碳青霉烯类耐药肠杆菌目和鲍曼不动杆菌（CRE和CRAB）持续被列为关键病原体。临床证据表明，持久性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与治疗失败和死亡率升高显著相关。因此，有限的抗菌药物选择和细菌顽固性可能加剧治疗难度，需要更有效的策略。临床上，抗菌药物敏感性试验（AST）广泛用于确定细菌对抗菌药物的敏感性并指导临床用药，但无法检测持留菌，也不能区分药物敏感、持留或耐受菌株。持留或耐受菌株很可能被误分类为敏感菌株，导致抗生素给药不当，从而无法彻底根除细菌并引起持续感染。持留菌代谢缓慢或降低，在抗生素去除后可重新生长，也可通过基因突变和水平基因转移在耐药菌株中发展。因此，迫切需要开发能够有效区分持留和敏感性的新型实验方法。已发表的综述虽涉及细菌持留菌的某些方面，但缺乏最新研究进展和全面阐述。本综述系统而全面地讨论了细菌持留，包括持留菌的鉴定、参与持留菌形成的细菌途径、细菌-宿主相互作用，以及持留菌的最新检测方法和对策。首先总结了持留菌的鉴定和生理学，特别是新提出的与持留菌相关的聚集体（aggresomes）。此外，详细阐述了细菌持留的潜在机制及其与宿主的相互作用。涉及的细菌途径包括毒素-抗毒素系统、代谢、群体感应、SOS反应、严谨反应、外排泵系统、小非编码RNA和表观遗传修饰。值得注意的是，讨论了细菌与宿主之间的相互作用，包括细菌适应以及宿主先天和适应性免疫受损。还介绍了传统和新型检测方法，特别是单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞拉曼光谱（SCRS）和基于聚集体的生物标志物检测。最后，针对持留菌的下一代对策强调了新兴方法，即噬菌体衍生疗法、联合策略和宿主知情的抗持留菌策略。
2. 2.
   持留菌的定义与鉴定
   持留菌是暴露于致死抗生素浓度和不良应激物（如较低pH和ROS）下存活的细菌亚群（通常少于1%），表现出非遗传特性、可逆转变和表型多样性，呈现休眠或缓慢生长状态，代谢降低，包括缓慢生长的可培养持留菌和休眠不可培养持留菌，如活但不可培养细胞（VBNCs）。根据先前研究，持留菌通常分为两类：由应激物诱导的I型持留菌（触发持留）和自发产生的II型持留菌（自发持留）。为了更好地区分持留菌与其他群体的异质性，提出了阴阳模型，其中阳代表细菌生长群体，阴代表缓慢或非生长的持留菌。持留菌群（阴）包含具有不同代谢状态的各种亚群，根据细菌代谢和生长，持留深度也分为浅持留和深持留。持留细胞通常被认为表现出浅持留水平，以代谢活动缓慢为特征，而具有更深持留水平的持留细胞，即代谢休眠状态，可进入VBNCs，在去除不利因素后难以重新生长。PhoU作为一种全局负调控因子，被认为是调节大肠杆菌代谢强度的持留开关。此外，小菌落变异（SCVs）的出现可能与某些物种（尤其是金黄色葡萄球菌）中持留菌比例增加有关。持留菌的形成和变异还取决于细菌种类、刺激物（如抗生素和pH）以及宿主微环境。
   与持留不同，耐受是群体范围的集体状态，其中一些可以在没有耐药基因和MIC值改变的情况下存活，被视为持留的延续。异耐药菌株是携带与耐药相关基因突变且具有不同MICs的细菌亚群，可发展为稳定或不稳定耐药菌株。因此，区分敏感、持留、耐受、异耐药和耐药菌株极为关键。
   杀死99%和99.99%细菌种群的最短时间分别定义为MDK₉₉和MDK_99.99，后者是时间-杀伤曲线中区分这些术语的常用方法。敏感菌株表现出低MDK₉₉和MDK_99.99值，呈现快速杀伤；耐受菌株具有高MDK₉₉但MIC敏感，表现为延迟杀伤。持留和敏感菌株初期杀伤动力学相似，MDK₉₉值均较低，但持留菌株的MDK_99.99阈值显著升高，在实验后期表现出延迟杀伤，最终呈现以残留持留亚群为主的两相杀伤曲线。异耐药和耐药菌株在抗生素暴露下表现出显著增加趋势。总之，持留、耐受和异耐药是从敏感菌株到耐药菌株的一系列中间状态。
   持留菌和持续感染并非完全互为因果，应在定义上加以区分。持留菌通常指各种细菌中的特定表型和生理状态：代谢较低（持留菌的一般特征）和位于细胞两极的聚集体形成（部分持留菌）。聚集体形成和去聚合可通过mRNA富集和储存调节持留深度和持留菌复苏。此外，持留菌构成细菌亚群，其比例可随不同刺激而动态变化。持续感染是一种以长期和难治性感染为特征的临床现象。持留菌可在感染期间存活并导致慢性持续感染，但持续感染也可由其他机制引起，如宿主免疫障碍、未知病原体感染和缺乏特效药物。越来越多的证据证明了革兰阴性菌和革兰阳性菌中持留菌与持续感染之间的正相关。
3. 3.
   参与持留菌的细菌途径
   持留菌的形成和持留深度复杂多样，涉及毒素-抗毒素系统、代谢、SOS反应和严谨反应、转译翻译（trans-translation）和蛋白质降解系统、外排泵系统、小非编码RNA等，这些途径可被抗生素、营养限制、活性氧、活性氮（RNS）和酸性pH激活，导致聚集体形成、ATP水平降低和蛋白质翻译抑制。

3.1. 毒素-抗毒素系统

毒素-抗毒素（TA）系统通常由稳定的毒素和不稳定的抗毒素组成，分别由毒素基因和抗毒素基因编码，广泛分布于细菌质粒和染色体上。在应激条件下，抗毒素高度不稳定，易被蛋白酶降解和失活，导致毒素与抗毒素失衡，加剧持留菌形成。根据TA系统的性质和作用机制，分为8类，其中I型和II型与持留菌密切相关。

在I型TA系统中，抗毒素是毒素mRNA的反义RNA，可结合毒素mRNA形成双链RNA，促进毒素mRNA降解或阻断核糖体结合，最终抑制毒素产生。I型毒素根据定位和机制分为膜相关毒素和胞质毒素，前者与持留密切相关。膜相关I型毒素通常是小蛋白，如大肠杆菌中的sokB/hokB、istR/tisB和ohsC/shoB，以及金黄色葡萄球菌中的sprA1_AS/sprA1和sprF1/sprG1。这些毒素通过在内膜上形成孔道破坏细菌膜，增加膜通透性，促进膜去极化，破坏质子驱动力（PMF），从而抑制ATP生物合成并触发细胞休眠。

II型TA系统是最丰富且研究最深入的TA系统。II型毒素可通过干扰DNA促旋酶和作为mRNA内切酶抑制复制和翻译。在应激条件下，不稳定的抗毒素可被蛋白酶（如Lon和ClpP）降解，毒素从复合物中释放，发挥杀菌或抑菌作用。越来越多的发现表明，毒素基因过表达可加剧细菌持留。然而，由于II型TA系统的丰度和转录交叉激活，初始五个模块敲除后持留菌水平不受影响，显示了TA的功能冗余。

一系列II型TA系统与持留形成相关，包括hipBA、relBE、mazEF、dinJ-yafQ、tacAT、yefM-yoeB、pemIK、mqsAR、ccdAB和KacAT。hipA基因首先被确定为细菌持留的关键遗传决定因素，编码HipA毒素蛋白。该毒素与其同源抗毒素HipB相互作用形成HipBA毒素-抗毒素系统。在大肠杆菌中，HipA通过磷酸化灭活氨酰-tRNA合成酶，如谷氨酰-tRNA合成酶（GltX）和TrpS，并作为mRNA内切酶降解mRNA，从而抑制翻译并促进持留形成。此外，在肺炎克雷伯菌中，HipA也可通过磷酸化介导翻译后调节。有趣的是，肺炎克雷伯菌的HipA对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有毒性，其毒性也可通过过量产生抗毒素HipB来中和。此外，HipBA由产克雷伯菌质粒携带，暗示hipBA作为可移动遗传元件上的 cargo 在不同物种间传播持留的潜力。除hipBA外，kacAT也能促进持留形成。添加美罗培南后，Lon蛋白酶被激活，促进抗毒素KacA降解，导致KacAT操纵子转录抑制释放，KacT和KacAT过表达也增加了肺炎克雷伯菌的持留性。在铜绿假单胞菌中，NatT介导的NAD和NADP耗竭通过减少ATP合成驱动持留形成。在金黄色葡萄球菌中，毒素MazF过表达靶向必需细胞和代谢过程，导致持留细胞形成。此外，II型毒素-抗毒素系统的VapBC家族普遍存在于结核分枝杆菌中，在氧化应激条件下细菌存活中起关键作用。

3.2. 代谢

越来越多的证据表明，细菌低代谢和休眠与持留密切相关，包括能量代谢、氧化还原平衡、氨基酸代谢和一系列代谢调节因子，从而大幅降低抗生素疗效。

3.2.1. 能量代谢

持留菌通常进入休眠或低代谢状态，其特征是细胞内ATP水平降低，导致蛋白质、肽聚糖和DNA合成减少。同时，持留菌可伴随聚集体产生。聚集体含有丰富延伸因子EF-Tu，可抑制翻译从而诱导持留。因此，ATP耗竭是驱动聚集体形成的主要力量。DnaK-ClpB可结合并降解聚集体，干扰编码DnaK-ClpB的基因会影响持留菌的恢复。细菌砷酸盐预处理也可降低ATP水平并导致抗生素持留。相反，补充葡萄糖可显著提高细胞内ATP水平并减少持留细胞群。因此，涉及ATP合成的一系列反应，如糖酵解、三羧酸（TCA）循环和电子传递链，可能通过干扰ATP生成影响持留形成。特别是降低ATP依赖性抗生素靶标的活性可增加细菌对杀菌抗生素的持留性，如β-内酰胺类和氨基糖苷类，因为这些抗生素依赖活跃的细菌代谢来发挥抗菌活性。

TCA循环被视为能量生成中心，抑制TCA循环或将碳通量转向乳酸发酵和乙醛酸分流途径，可在抗生素下加速细菌持留。在抗生素压力和营养限制下，糖酵解代谢可通过将丙酮酸从氧化代谢转向发酵而重编程，这有效减弱ROS产生，并通过稳定关键的NAD⁺/NADH平衡促进细胞氧化还原稳态，从而促进细菌代谢适应和持留存活。此外，破坏与TCA循环相关的基因可能对抗生素持留产生不同影响。破坏某些基因（如sucB、sucC和sucD）会减少细菌持留，而失活乌头酸酶编码基因acnB则矛盾地增加细菌持留能力。毒素诱导的NAD⁺/NADH比率下降通过破坏电子传递链导致持留形成。维持PMF对ATP生成至关重要。用质子载体CCCP和水杨酸盐预处理细菌可破坏PMF，导致ATP水平降低，从而诱导细菌持留。

3.2.2. 氨基酸代谢

在细菌持留细胞内，氨基酸代谢在控制表型持留中起关键作用。谷氨酸代谢是氨基酸代谢与持留之间研究最充分的联系。谷氨酸转运蛋白（如gltS、gltP、gltB和gltI）的缺失导致大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对几种抗生素和应激物的耐受性减弱，这已在体外和小鼠模型中得到验证。此外，谷氨酸代谢相关基因失活也损害鲍曼不动杆菌的抗生素耐受性。谷氨酸脱氢酶（由gdhA编码）催化α-酮戊二酸转化为谷氨酸，其失活导致α-酮戊二酸积累并增加TCA循环活性，从而减少持留形成。MurI1、AspB和RacD可从L-谷氨酸生成D-谷氨酸和D-天冬氨酸，对细菌细胞壁构建至关重要。删除aspB、murI1和racD会损害抗生素持留。此外，hipA2编码激酶通过破坏细胞内色氨酸-谷氨酰胺平衡促进细菌持留。除谷氨酸外，甲硫氨酸生物合成途径中的第一个酶MetA在各种应激条件下也容易聚集，这种聚集导致甲硫氨酸限制。由于甲硫氨酸是翻译起始所必需的，MetA聚集下调翻译并诱导细菌持留。此外，组氨酸生物合成途径也影响细菌持留。hisF失活抑制组氨酸生物合成途径，同时降低细胞ATP水平以诱导细菌持留。色氨酸代谢物吲哚-3-乙酸（IAA）缺乏显著增加金黄色葡萄球菌在小鼠中的存活，补充IAA也抑制体外细菌持留菌的形成。BrnQ1（编码支链氨基酸转运蛋白）突变损害金黄色葡萄球菌在巨噬细胞内的复制能力，并驱动细菌群体进入代谢静止状态，这可通过补充支链氨基酸来挽救。此外，参与精氨酸生物合成的乙酰转移酶编码基因argJ在药物应激和稳定期培养物中的金黄色葡萄球菌持留形成中也起关键作用。

3.2.3. 嘌呤代谢

嘌呤代谢是与持留菌关联良好的核苷酸代谢途径之一，它还影响细菌能量代谢、生物膜、聚集体形成和外排泵。腺苷和鸟苷是嘌呤代谢的衍生物，为DNA和RNA合成提供必需成分，有助于增加ATP水平并维持细菌存活和增殖，特别是在宿主内感染和抗生素暴露等不利条件下。大量证据表明，细胞内较低ATP和聚集体形成与持留有关。上调腺苷和鸟苷生物合成或补充外源腺苷和鸟苷可提高ATP水平，增强抗生素杀伤（如四环素、庆大霉素和环丙沙星），并抑制外排泵活性，最终加速持留菌的根除。然而，嘌呤生物合成途径不同组分基因失活对细菌持留产生不同影响。磷酸核糖焦磷酸（PRPP）合成酶（Prs）是ATP生物合成途径中PRPP产生所需的关键酶。Prs突变与持留形成有关，可能通过延长滞后期和增加抗生素持留。一系列pur基因编码嘌呤生物合成途径的必需组分。大多数研究表明，pur基因（purA、purD、purE、purF、purK、purM、purN和purR）有助于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伯克霍尔德菌体外向持留状态转变。此外，临床菌株的基因表达谱显示，purF高表达在持久性MRSA菌血症体内起关键作用，提示抗持留靶点。然而，一些研究表明pur基因失活导致对抗生素杀伤的不同反应。例如，大肠杆菌中purM截短失活增强对环丙沙星的耐受性，而其突变（F105A）使细菌对庆大霉素介导的杀伤更敏感。不一致的发现可能归因于抗生素特异性、物种差异和方法学差异。

嘌呤衍生的环二腺苷酸（c-di-AMP）上调生物膜产生并促进细菌抗生素持留，而其合成破坏（如purN失活）减少持留亚群。另一衍生物环磷酸腺苷（cAMP）作为全局调节因子，其缺失或下调减少ROS富集并减轻氧化损伤，进而增加大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的持留形成。相反，外源添加cAMP可减少持留形成，但也可被使用cAMP抑制剂阿托品逆转。crp编码的cAMP受体蛋白（CRP）结合cAMP以激活持留菌中与分解代谢相关的基因。多核苷酸磷酸化酶（PNPase）可结合crp mRNA的5'-UTR负调节CRP蛋白，从而降低细胞内代谢并促进持留形成。

3.2.4. 其他调节因子

全局调节因子，包括整合宿主因子（IHF），不仅调节细菌毒力，还影响持留形成。IHF将碳流重定向到乙醛酸旁路以降低ATP水平，从而增强大肠杆菌持留形成。此外，磷酸盐特异性转运系统辅助蛋白phoU被鉴定为与持留相关的新基因，其失活可导致细胞代谢过度活跃状态，对多种应激物（包括抗生素、饥饿和酸性pH）敏感性增强。相反，phoU基因互补通过抑制代谢活性和增加细胞内存活促进持留形成。

3.3. SOS反应与DNA损伤修复

SOS反应在持留形成中起重要作用。抗生素、过量ROS、重金属和其他因素诱导的DNA损伤可触发SOS调节子基因（如lexA、recA和tisB）表达以激活SOS反应。在大肠杆菌中，lexA编码LexA，作为转录抑制因子结合多个SOS基因启动子区域。recA编码RecA，通过切割LexA作为去抑制因子，并作为DNA结合激活蛋白诱导与SOS修复起始相关的基因表达。敲除recA基因后，大肠杆菌降低了对环丙沙星的持留性，但对青霉素和庆大霉素无影响。此外，ROS也激活SOS反应并促进洋葱伯克霍尔德菌在吞噬体内暴露于环丙沙星时的持留。作为之前提到的，为应对DNA损伤，SOS调节子基因tisB表达上调，导致PMF崩溃和ATP耗竭，从而诱导持留并促进DNA损伤修复。尽管遗传同质性和相同MIC，亚抑制浓度环丙沙星可诱导SOS反应激活的显著异质性，具有较高SOS反应表达的临床分离株比较弱反应菌株更易进一步进展为耐药。此外，在重金属暴露下，可发现SOS相关基因上调和细胞内ATP耗竭，促进金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的持留存活。

RecBCD依赖性同源重组涉及RecA、RecB、RecN、RecG和RuvA/B，在SOS诱导的DNA损伤修复中起重要作用。氟喹诺酮类是引起细菌DNA双链断裂（DSBs）的常见抗生素，可在持留菌中积累并在重新生长前修复。不完全修复抑制持留菌复苏并倾向于中止VBNCs，修复抑制可有效消除氟喹诺酮类持留菌，类似于敏感菌株。与上述物种相反，铜绿假单胞菌不依赖于DSBs和损伤修复系统，而是避免DSBs以在氟喹诺酮类治疗期间持留。

3.4. 严谨反应与RpoS

越来越多的研究证明严谨反应与细菌持留之间存在显著相关性。严谨反应是对应氨基酸饥饿、磷酸盐、碳和氮限制的压力反应，(p)ppGpp是该过程中的关键信使分子。通过与转录因子DksA相互作用，(p)ppGpp修饰RNA聚合酶，协调转录转变，在营养限制期间抑制核糖体生物合成基因，同时激活对细菌持留至关重要的应激反应调节子。在大肠杆菌中，(p)ppGpp合成酶基因relA可被氨基酸饥饿和热休克激活，(p)ppGpp合成酶/水解酶基因spoT（合成弱于relA）被碳、氮和磷酸盐激活。(p)ppGpp介导调节的主要靶标取决于警报素直接结合RNAP的β'和ω亚基。相反，(p)ppGpp不足通常显示持留形成和存活的显著缺陷。在巨噬细胞内的沙门菌中，编码硫转移酶复合物的yheM失活导致蛋白质聚集和RelA激活，促进(p)ppGpp产生和稳定期持留形成，而(p)ppGpp合成缺陷不影响指数期yheM突变株的持留。然而，(p)ppGpp与Lon蛋白酶在持留细胞形成中作用于同一通路的关联无法得到验证。在肺炎克雷伯菌中，DksA正向参与生物膜形成和荚膜合成，促进肠道定植和持续感染，特别是在营养限制环境或宿主体内。

(p)ppGpp还通过调节RNA聚合酶σ因子RpoS激活细菌应激反应，RpoS调节参与应激反应的许多途径的转录水平。删除rpoS可严重损害(p)ppGpp水平，从而导致relA缺陷大肠杆菌菌株中持留菌减少。相反，RpoS也抑制持留形成，其失活明显增加大肠杆菌对氨苄西林和诺氟沙星的持留性。矛盾的结果可能由菌株特异性、应激物、通路复杂性和实验设计差异引起，需要更深入的研究。此外，敲除rpoS由于缺乏SoxS、过氧化氢酶和(p)ppGpp而导致肠炎沙门菌形成VBNC。

3.5. 外排泵系统

外排泵通常由多个基因编码形成跨膜蛋白复合物，主动排出抗生素、毒素或其他有害物质。越来越多的研究表明，过度活跃的外排泵活性可降低细胞内抗生素（如氟喹诺酮类和β-内酰胺类）的积累水平，维持较低的细胞内抗生素浓度，从而诱导持留菌形成。此外，在抗生素暴露前也在持留菌中检测到较高TolC水平。相反，积累细胞内抗生素与持留菌消除相关。研究充分的AcrAB-TolC外排泵属于耐药结节分化（RND）家族，主要存在于革兰阴性菌中，与持留形成相关。敲除AcrAB-TolC编码基因（acrA、acrB和tolC）可触发对β-内酰胺类、氧氟沙星和四环素耐受的持留菌形成，而联合外排抑制剂与抗生素可有效减少持留形成。此外，负调控因子AcrR也可通过影响大肠杆菌和维氏气单胞菌中AcrAB-TolC表达调节持留形成。有趣的是，在肺炎克雷伯菌中，敲除tolC可增加对妥布霉素的持留性，但对环丙沙星无影响，这可能与不同抗生素作用机制引起的特定应激有关。

另一种RND外排泵是Ade，包括AdeABC、AdeFGH和AdeIJK，主要在鲍曼不动杆菌中表达，删除阻遏物adeG可增加整体外排活性，导致持留菌形成。具体而言，adeG缺失可上调csu/pil操纵子，增强细菌的疏水性和表面运动性，从而促进浮游聚集体的形成。同时，聚集体可降低细胞内ATP并触发代谢休眠，增强对美罗培南、庆大霉素和多粘菌素B的持留性，产生持留菌并引起持续感染。此外，在铜绿假单胞菌生物膜内持留菌中也观察到ABC转运蛋白表达增加，正调控因子BrlR上调编码ABC转运蛋白的基因以诱导持留。

众所周知，外排泵过表达可通过增加外排介导对不同类别抗菌剂的耐药，包括β-内酰胺类和四环素类，尽管通常是低水平耐药。然而，外排泵在持留和耐药之间的功能差异仍不清楚。实际上，持留菌内高表达的外排泵不仅泵出抗生素，还可能去除与抑制持留形成相关的细胞内物质或持留菌诱导的信号分子，从而促进持留亚群比例增加。此外，外排泵可能在应激下诱导持留形成但不影响预先存在的持留菌，而外排泵介导的耐药通常是预先存在而非诱导的。未来需要机制研究来解决这一问题。

3.6. 转译翻译（trans-translation）

转译翻译广泛分布于细菌中，由转移-信使RNA（tmRNA，也称为ssrA）及其伴侣蛋白SmpB组成，在应激条件下解救停滞的核糖体和解毒毒性蛋白中起重要作用。研究人员首次报道转译翻译参与持留形成。ssrA和smpB失活可提高对多种抗生素和应激的敏感性，损害持留存活，并可通过功能性ssrA和smpB互补。涉及的途径不同：SsrA有助于RelA产生以促进(p)ppGpp合成，从而促进持留形成；相反，敲除SsrA和SmpB严重损害(p)ppGpp产生并导致持留水平降低。此外，SmpB突变株比SsrA突变株对抗生素和不利应激更敏感。在维氏气单胞菌中，SmpB还通过减少质子驱动力促进持留形成并增加对氨基糖苷类的耐受性，这可通过PMF抑制来验证。此外，具有转译翻译的细菌可在巨噬细胞中逃逸吞噬体并避免吞噬溶酶体形成以存活。转译翻译还调节通过Wzy依赖性荚膜合成途径产生荚膜，促进抗原变异和掩蔽，以及补体激活逃避，从而无法有效识别、吞噬和免疫杀伤。此外，转译翻译可消除无终止核糖体复合物并释放停滞的核糖体，有助于恢复由过量毒素MazF和RelE引起的大肠杆菌持留菌。

3.7. 群体感应（QS）系统

群体感应（QS）是监测种群密度的常见生物现象，在调节细菌生理（如生物膜形成、外排泵活性、分泌系统和应激反应）中起关键作用，这与细菌持留菌的形成和维持有关。不同细菌具有不同的QS系统。大多数革兰阴性菌的QS系统是LuxI/R型，而大多数革兰阳性菌主要涉及自诱导肽（AIPs），后者需要ATP结合盒（ABC）转运系统或膜通道蛋白进行细胞内和细胞外转运。

大肠杆菌和铜绿假单胞菌是研究QS在持留菌中功能的两种代表性革兰阴性菌。大肠杆菌的QS包括LuxR同源物（SdiA调节因子）、LuxS（合成酶）/自诱导物-2（AI-2）和自诱导物-3（AI-3）系统，使大肠杆菌能够感知并响应周围环境。积累研究表明，SdiA可负调节生物膜产生以减少细菌持留，而AI-2促进生物膜形成和持留。在铜绿假单胞菌中，QS与c-di-GMP连接，同时促进生物膜的基质基因表达，上调RND泵（mexAB-oprM和mexEF-oprN）及相关正调控因子（brlR和sagS），有利于持留形成，甚至VBNCs。

在金黄色葡萄球菌中，附属基因调节子（agr）系统在高保守的群体感应机制中起重要作用，增加细菌致病因子表达。因此，抑制agr表达是降低金黄色葡萄球菌毒力的重要方法。然而，抑制agr导致粘附蛋白持续表达并减少蛋白酶表达，导致生物膜持留。值得注意的是，agr功能障碍与危重患者较高死亡率有关。在变形链球菌中，应激诱导的警报素群体感应肽CSP可通过非经典SOS反应上调lexA表达，增加持留形成。因此，QS在不同物种的细菌持留中发挥不同作用，需要研究潜在机制以根除持留菌。

3.8. 其他分子机制

小非编码RNA（sRNAs）在细菌中丰富多样，通过阻碍核糖体结合位点和降低mRNA稳定性来调节翻译过程，影响环境变化（如抗生素和ROS应激）期间的细菌生理行为。不同sRNA通过调节生物膜形成介导持留发挥不同作用。sRNA CsrB和CsrC可抑制生物膜的负调控因子CsrA蛋白，增加大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌中的生物膜形成。此外，多细胞粘附sRNA McaS也通过升高c-di-GMP水平发挥类似功能。相反，sRNA RprA抑制csgD mRNA翻译以减少生物膜形成，这被荚膜调节因子RcsB增强。此外，sRNA还调节孔蛋白表达以影响抗生素进入。sRNA micF和micC降低产气肠杆菌中Omp35和Omp36的表达。另外，sRNA RyhB通过增加(p)ppGpp水平参与持留形成。ryhB缺陷菌株也升高ATP水平并降低NAD⁺/NADH比率，导致大肠杆菌代谢过度活跃。

表观遗传修饰，如DNA/RNA甲基化，也通过间接调节某些基因组位点的表达影响细菌持留。编码DNA腺嘌呤甲基化（dam）的基因突变导致持留形成显著下降，基因互补可恢复大肠杆菌的持留性。有趣的是，表观遗传“记忆”由后进先出规则提出，但其存在存在争议。m¹G37-tRNA甲基化可通过调节与膜相关基因脯氨酸密码子的翻译来控制多种膜蛋白的合成，从而间接调节细菌持留，这主要由药物外排介导。