利用布氏酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）与红茶菌（kombucha）培养物混合发酵作为生产具有抗菌活性蜂蜜酒（mead）的策略

《Foods》：Mixed Fermentation Using Saccharomyces cerevisiae var. boulardii and Kombucha Culture as a Strategy for the Production of Mead with Antimicrobial Activity

　　

本研究评估了利用布氏酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）与红茶菌（kombucha）培养物混合发酵、以桉树单花蜜和迷迭香单花蜜为原料生产的蜂蜜酒（mead）的抗菌活性。研究人员在28天贮藏期内，于体外针对致病细菌（大肠埃希菌 Escherichia coli、肠炎沙门菌 Salmonella enterica、无害李斯特菌 Listeria innocua、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 和蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus）及腐败酵母检测了抗菌活性。所有待测基质在抗菌评价前均经121 °C、15 min高压灭菌以灭活发酵微生物。此外，研究人员在不同底物浓度的模拟食品体系中开展试验，并对有机酸、还原糖及挥发性化合物进行表征。未发酵的蜜汁中无害李斯特菌与蜡样芽孢杆菌可存活，迷迭香蜜的抗菌效应强于桉树蜜。红茶菌表现出较强的初始抑制能力，可能与其高浓度有机酸有关，但未能完全抑制革兰阳性菌生长。发酵蜂蜜酒基质中未检出致病细菌生长，可能归因于可发酵糖降低、乙醇、有机酸及其他发酵代谢物的协同作用。腐败酵母对酸与渗透胁迫耐受性高，且在富底物体系中效能下降。需强调的是，本文报道的抗菌活性特指经高压灭菌的发酵基质，未必适用于未经处理的发酵饮料。

研究背景与立项依据

天然抗菌体系在食品防腐与“清洁标签（clean label）”开发中备受关注。蜂蜜凭借低水活度、高渗、低pH、过氧化氢及酚类等机制具备广谱抑菌性，而红茶菌（kombucha，由醋酸菌与酵母共生的SCOBY发酵）因有机酸（尤其乙酸）与茶多酚改性产物亦具抑菌潜力。布氏酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）作为益生菌酵母，其细胞壁甘露糖残基与抗菌因子可在灭活后保留细胞相关特性，被视为潜在后生元（postbiotic）。将三者结合用于蜂蜜酒（mead）混合发酵，有望在不依赖化学防腐剂前提下提升微生物安全性，但发酵基质经热处理后可溶性代谢物的真实抑菌贡献及在营养丰富食品体系中的转移效果尚不清楚。为此，研究人员以桉树蜜与迷迭香蜜为原料，采用布氏酿酒酵母联合红茶菌培养物进行9天混合发酵（25 °C），并在体外评价灭菌后基质对食源性病原细菌与腐败酵母的抑制能力，模拟低/高营养体系以探明其作为天然防腐配料的可行性。该文发表于《Foods》。

主要技术方法概览

研究人员构建七类基质：桉树蜜未接种汁（EHM）、迷迭香蜜未接种汁（RHM）、红茶菌（K）、接种即刻桉树蜜汁（EM-T0）、接种即刻迷迭香蜜汁（RM-T0）、发酵桉树蜂蜜酒（EM）、发酵迷迭香蜂蜜酒（RM）；所有待测液均经121 °C 15 min高压灭菌以消除活菌干扰。抗菌评价采用spot-on-lawn法，将靶微生物以10⁵ CFU/μL接种于含待测基质的冷冻管，于23 °C贮藏并在0、7、14、28天做10倍系列稀释点板计数（细菌BHI 37 °C、酵母YPD 25 °C，72 h判读）。模拟食品体系则将灭菌基质按10%、25%、50%（v/v）掺入4%琼脂、YPD或BHI（各占50%），以无菌水补足，考察营养可用性影响。化学表征采用HPLC（Rezex ROA有机酸H⁺柱，65 °C，5 mM H₂SO₄流动相0.5 mL/min），UV检测有机酸、示差折光检测糖/乙醇/甘油，数据以Kruskal–Wallis非参检验（Conover-Holm校正）处理。样本队列源自葡萄牙ISA酵母保藏中心与当地市售单花蜜，无独立阳性生长对照。

研究结果

3.1 产品对致病细菌的体外抑制能力

未发酵EHM中无害李斯特菌与蜡样芽孢杆菌持续存活28天，RHM因迷迭香蜜酚类与有机酸谱差异仅短暂检出前者；红茶菌（K）初始对李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌抑制强（乙酸0.250 g/100 g、乳酸0.156 g/100 g、苹果酸0.243 g/100 g），但28天内高接种量下革兰阳性菌复现，归因于李斯特菌GAD（谷氨酸脱羧酶）-SigB酸应激系统与蜡样芽孢杆菌孢子耐受。接种即刻汁（EM-T0/RM-T0）与未接种汁行为相近，说明短期接种未增产抗菌物。发酵后EM与RM在28天内五株病原细菌均无生长：果糖（EM 11.996→10.007 g/100 g，RM 12.914→12.464 g/100 g）、葡萄糖（EM 8.345→4.937 g/100 g，RM 8.364→7.018 g/100 g）显著消耗，残留乙醇仅1.201%（EM）与0.481%（RM），抑菌源于可发酵糖下降、酸化、残留乙醇、布氏酵母与SCOBY代谢物协同（栅栏技术 hurdle technology），但因全程基质经灭菌，热改性与发酵贡献不可分离。

3.2 产品对污染酵母的体外抑制能力

对Pichia manshurica、Candida stellata、Millerozyma farinosa、Zygosaccharomyces bailii、Zygosaccharomyces rouxii五株腐败酵母，28天内各基质均无种群下降。这些酵母具积累甘油等兼容溶质（compatible solutes）的渗透调节、膜脂改构、弱有机酸与中等乙醇耐受（如Z. rouxii耐pH≈2.0），蜂蜜酒中低乙醇（<1.5% v/v）与中等酸化不足以突破其生理阈值，表明细菌抑制栅栏对酵母无效。

3.3 不同底物浓度下的体外抗菌活性

将基质按10%–50%掺入YPD/BHI等富营养介质时，所有样品（含EM/RM）对细菌与酵母均无抑制；纯4%琼脂中细菌不生长（营养限制主导），酵母仍生长并可同化基质内碳源。证明抗菌效能高度依赖介质营养可用性，富底物食品体系中直接添加≤50%灭菌蜂蜜酒难以发挥抑菌作用。

讨论与结论翻译

讨论指出，灭菌发酵蜂蜜酒对革兰阴/阳性病原细菌的无生长结果，应归因为糖耗竭、乙醇、有机酸及蜂蜜本源生物活性物多因子协同，而非单一化合物；热灭菌步骤本身可能修饰抗菌组分，故该活性不可外推至未处理饮料。酵母耐受性凸显未来需降残糖、促抗真菌代谢或耦联非热技术（HPP、PEF）。结论部分原文意译如下：

综上，经热处理的桉树（EM）与迷迭香（RM）蜂蜜酒通过布氏酿酒酵母与红茶菌微生物混合发酵，对大肠埃希菌、肠炎沙门菌、无害李斯特菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽孢杆菌表现出高抗菌活性；相较于无营养补充的对应未发酵蜜汁，热灭菌发酵基质活性更强，提示发酵引起的可发酵糖下降、乙醇与有机酸生成与蜂蜜天然酸度/生物活性物协同抑制细菌。反之，该蜂蜜酒对Pichia manshurica、Candida stellata、Millerozyma farinosa、Zygosaccharomyces bailii与Zygosaccharomyces rouxii等腐败酵母活性有限，反映上述菌种对样品理化条件的高耐受性。在高中营养模拟食品体系中，即便基质添加达50%亦无抑制，表明其抗菌有效性依赖基质且于富底物环境衰减。因此，本研究提供经高压灭菌发酵基质体外抗菌的初步证据，但该活性对腐败酵母无效且在富营养实验室介质中缺失；所报活性特指热处理发酵基质，未必适用于未处理发酵饮料。需在真实食品体系进一步评估杀菌活性、有效浓度、感官、安全性与益生菌功能。