从茶叶栽培到品质评价的计算机视觉

《Foods》：Computer Vision from Tea Cultivation to Quality Evaluation

　　

本研究评估了由布拉氏酵母（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）和康普茶培养物混合发酵生产的蜂蜜酒（mead）的抗菌活性，使用了桉树和迷迭香单花蜂蜜。研究人员在28天储存期内，针对致病菌（大肠杆菌Escherichia coli、肠炎沙门氏菌Salmonella enterica、无害李斯特菌Listeria innocua、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus）和腐败酵母进行了体外抗菌活性研究。所有测试基质在抗菌评估前均于121 °C下高压灭菌15分钟，以消除活发酵微生物。此外，研究人员在不同底物浓度的模拟食品系统中进行了检测，表征了有机酸、还原糖和挥发性化合物。未发酵的葡萄汁允许无害李斯特菌和蜡样芽孢杆菌存活，其中迷迭香蜂蜜显示出比桉树蜂蜜更强的抗菌效果。康普茶表现出强烈的初始抑制作用，可能与其高浓度有机酸有关，但并未完全抑制革兰氏阳性菌的生长。在发酵的蜂蜜酒基质中未检测到致病菌生长，可能归因于可发酵糖减少、乙醇、有机酸及其他发酵代谢物的存在。腐败酵母对酸和渗透胁迫表现出高耐受性，且在富含底物的系统中效力下降。重要的是，本文报告的抗菌活性特指高压灭菌后的发酵基质，并不一定适用于未经处理的发酵饮料。

**论文解读：混合发酵蜂蜜酒的抗菌活性及其在食品保鲜中的应用潜力**

**研究背景与问题**
在食品工业中，天然抗菌剂的应用日益受到关注，尤其是来源于动物、植物和微生物的化合物，如酶、生物活性肽、酚类物质、有机酸及发酵代谢物。蜂蜜作为富含糖类的天然产物，其抗菌活性源于低水分活度、高渗透压、低pH、过氧化氢生成以及酚酸和黄酮类化合物等生物活性成分的综合作用。然而，不同蜜源植物的蜂蜜化学组成差异显著，导致抗菌效果不一。康普茶（kombucha）是一种由醋酸菌和酵母共生培养物（SCOBY）发酵的茶饮料，其抗菌活性主要与低pH、有机酸（尤其是乙酸）及发酵过程中生成或修饰的酚类化合物有关。此外，益生菌布拉氏酵母（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii，S. boulardii）具有胃肠道条件下的生理活性，并能产生抗微生物因子。消费者对“清洁标签”和功能性食品的需求增加，推动了益生菌饮料的开发，但酒精饮料领域的探索仍相对有限。在此背景下，研究人员创新性地提出通过S. boulardii与康普茶培养物混合发酵生产潜在益生菌蜂蜜酒（mead），旨在利用天然活性原料和特定发酵微生物的组合，控制致病菌和腐败微生物，减少化学防腐剂的使用，并探索其作为食品防腐成分的应用潜力。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：
1. **样品制备与发酵**：分别使用桉树蜂蜜（Euromel, Penamacor, Portugal）和迷迭香蜂蜜（Euromel, Penamacor, Portugal）配制葡萄汁（初始可溶性固形物25 °Brix），经65 °C巴氏灭菌30分钟后，接种S. boulardii（ISA 1028, 来自葡萄牙里斯本大学高等农学研究所ISA酵母菌种库）和康普茶培养物（来自ISA微生物菌种库），在25 °C下厌氧发酵9天，制备桉树蜂蜜酒（EM）和迷迭香蜂蜜酒（RM）。
2. **体外抗菌活性测定**：采用点种法（spot-on-lawn method），在121 °C高压灭菌15分钟后的样品（包括未发酵葡萄汁、康普茶、接种后立即取样的葡萄汁及发酵蜂蜜酒）中，接种致病菌（大肠杆菌Escherichia coli、肠炎沙门氏菌Salmonella enterica、无害李斯特菌Listeria innocua、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，均来自ISA菌种库）和腐败酵母（Pichia manshurica、Candida stellata、Millerozyma farinosa、Zygosaccharomyces bailii、Zygosaccharomyces rouxii），在23 °C下储存28天，于0、7、14、28天评估微生物生长情况。
3. **不同营养可用性系统的抗菌活性模拟**：将样品以10%、25%、50% (v/v)的比例分别加入低营养（4%琼脂）、富营养（酵母提取物蛋白胨葡萄糖YPD、脑心浸液BHI）培养基中，模拟食品体系，接种同样微生物后评估72小时后的生长抑制。
4. **有机酸、还原糖和挥发性化合物分析**：采用高效液相色谱（HPLC）系统（Chromaster, Hitachi, Tokyo, Japan），配备Rezex? ROA有机酸H+（8%）柱，流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.5 mL/min，紫外检测器（5420）和示差折光检测器（5450）分别检测有机酸、糖类及乙醇、甘油，每个样品独立重复三次。
5. **统计分析**：使用R软件（4.4.2版）进行非参数Kruskal-Wallis检验和Conover事后检验（Holm校正），显著性水平p < 0.05。

**研究结果**

**3.1 产品对致病菌的体外抑制能力**
通过对桉树蜂蜜未接种葡萄汁（EHM）、迷迭香蜂蜜未接种葡萄汁（RHM）、康普茶（K）、接种后立即取样的桉树蜂蜜葡萄汁（EM-T0）、接种后立即取样的迷迭香蜂蜜葡萄汁（RM-T0）、发酵桉树蜂蜜酒（EM）和发酵迷迭香蜂蜜酒（RM）的28天体外抗菌活性评估，研究人员发现：
- EHM和RHM中，无害李斯特菌和蜡样芽孢杆菌可存活，但迷迭香蜂蜜（RHM）的抗菌作用强于桉树蜂蜜（EHM），这与迷迭香蜂蜜更丰富的酚类和有机酸组成有关。
- 康普茶（K）在初始时间点对无害李斯特菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌表现出强抑制，但28天后仍观察到无害李斯特菌和蜡样芽孢杆菌生长，表明高酸性环境不足以完全抑制革兰氏阳性菌。蜡样芽孢杆菌的孢子形成能力可能解释了其存活。无害李斯特菌的谷氨酸脱羧酶系统（GAD）和Sigma因子B（SigB）介导的酸耐受机制也参与了其持续存活。
- 接种后立即取样的葡萄汁（EM-T0和RM-T0）与未接种葡萄汁相比，抗菌活性未显著增强，表明短时间内的微生物-底物相互作用不足以产生抑制效果。
- 发酵蜂蜜酒（EM和RM）在整个28天储存期内未检测到任何致病菌生长。这归因于发酵过程中可发酵糖（尤其是葡萄糖和果糖）的显著消耗（EM中葡萄糖从8.345降至4.937 g/100 g，果糖从11.996降至10.007 g/100 g；RM中葡萄糖从8.364降至7.018 g/100 g，果糖从12.914降至12.464 g/100 g），以及乙醇（EM中1.201%，RM中0.481%）、有机酸等代谢物的产生，这些因素通过栅栏技术（hurdle technology）协同作用抑制细菌。但需注意，所有基质均经高压灭菌处理，因此不能单独归因于发酵，热改性也可能有贡献。

**3.2 产品对腐败酵母的体外抑制能力**
对腐败酵母Pichia manshurica、Candida stellata、Millerozyma farinosa、Zygosaccharomyces bailii和Zygosaccharomyces rouxii的28天评估显示，所有样品均未表现出酵母种群减少。这些酵母物种具有高渗透压耐受性、酸耐受性、有机酸耐受性和中等乙醇耐受性，其生理适应机制（如细胞内相容溶质积累、膜脂组成调整、有机酸耐受系统）使其能够在蜂蜜酒基质中存活。例如，Z. bailii对弱有机酸、乙醇和高糖高度耐受，且具有嗜果糖特性；Z. rouxii能在pH接近2.0的极端酸性条件下生长。因此，蜂蜜酒的抗菌活性对细菌有效，但对腐败酵母效果有限，表明酵母的生理稳健性更强。

**3.3 不同底物浓度下产品的体外抗菌活性**
在富营养培养基（YPD和BHI）中，即使样品浓度高达50% (v/v)，所有样品均未抑制致病菌或酵母生长，表明高营养可用性促进了微生物代谢恢复和增殖，降低了抗菌效力。在无营养补充的琼脂培养基中，所有样品均抑制了细菌生长（因营养限制），但酵母仍能生长，表明酵母可利用样品本身作为碳源和能源。这一结果证实了发酵代谢物（如糖消耗、有机酸、乙醇）在细菌抑制中的关键作用，但抗菌效果高度依赖基质组成和营养条件。

**结论**
研究人员总结认为，经热处理的桉树蜂蜜酒（EM）和迷迭香蜂蜜酒（RM）通过混合发酵（S. boulardii和康普茶培养物）后，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、无害李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌）表现出高抗菌活性，抑制效果与发酵相关的组成变化（可发酵糖减少、乙醇和有机酸生成）及蜂蜜固有的酸度和生物活性化合物协同作用有关。然而，对腐败酵母（Pichia manshurica、Candida stellata、Millerozyma farinosa、Zygosaccharomyces bailii、Zygosaccharomyces rouxii）的活性有限，反映这些酵母的强耐受性。在模拟的高营养食品系统中，高达50%的基质浓度未显示抑制效果，表明抗菌效力依赖基质，在富含底物环境中减弱。因此，这些结果为高压灭菌发酵基质的体外抗菌活性提供了初步证据，但对腐败酵母无效且在富营养实验室培养基中缺失。重要的是，本研究报告的抗菌活性特指热处理后的发酵基质，不适用于未经处理的发酵饮料。未来需在真实食品系统中进一步评估杀菌活性、有效浓度、感官品质、安全性和益生菌功能。