《International Journal of Molecular Sciences》：Comprehensive Review of Extracellular Vesicles in Thyroid Cancer: From Methodological Approaches to Biological Functions and Clinical Applications
甲状腺癌（TC）是常见的内分泌恶性肿瘤之一，位居全球最常见癌症诊断前十之列，突显了改进诊断和监测策略的需求。细胞外囊泡（EVs）是几乎所有细胞类型释放的纳米大小的膜封闭颗粒，携带选择性分选的生物活性 cargo，能够影响受体细胞的行为和命运。尽管其分子组成由来源细胞塑造，但 cargo 装载是一个受调控的过程，有助于 EV 介导的细胞间通讯和细胞特异性靶向。在 TC 中，EVs 已成为肿瘤进展和微环境调节的重要介质。近期进展强调了 EVs 作为非侵入性生物标志物的诊断和预后价值，特别是通过检测 EV 相关的非编码 RNA、蛋白质、脂质和其他分子特征。然而，方法学变异性和有限的临床验证仍是临床转化的关键障碍。需要进一步的临床前和临床研究来确定 EVs 在 TC 液体活检和个性化靶向治疗中的作用。本综述提供了 TC 中 EVs 的全面系统概述，特别强调了影响 EV 研究的方法学因素，包括样本特异性分离和表征策略。基于系统的文献调查，本综述整合了关于 EV 相关 cargo、生物学功能、生物标志物和治疗潜力的现有知识，同时批判性地评估了方法学挑战，并概述了临床转化的未来方向。
**1. 引言**
源自甲状腺上皮细胞的肿瘤是临床最常见的内分泌肿瘤之一，其生物学行为从良性肿瘤到缓慢生长的癌，乃至快速致死的恶性病变，构成一个谱系。尽管大多数甲状腺肿瘤患者预后良好，但存在一部分需要更强化治疗的高风险患者，而识别这些患者对临床医生构成挑战。细胞外囊泡（EVs）已成为一个极具前景的研究领域，其 cargo 能反映来源细胞的分子状态或经过选择性分选，为改善患者管理提供了一种微创方式。在甲状腺癌（TC）中，EVs 携带可能促进肿瘤侵袭性的致癌分子。更好地理解 TC 来源的 EVs 可改善疾病监测，支持治疗监测，并帮助指导未来的治疗策略。
**2. 甲状腺癌**
目前，甲状腺癌（TC）位居全球十大最常见癌症诊断之列。源自滤泡上皮的甲状腺恶性肿瘤通常分为高分化型（DTC）、低分化型（PDTC）和未分化型（ATC）。这些 TC 亚型的生物学行为高度不同，反映在其转移模式、临床侵袭性和预后上的差异。甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占所有 TC 的 80%，预后通常良好，但易发生区域淋巴结转移。甲状腺滤泡状癌（FTC）约占 10-15%，常通过血行转移至骨和肺。嗜酸细胞甲状腺癌（OTC）是一种罕见亚型，生物学行为较 PTC 和 FTC 更具侵袭性。与 DTC 相反，ATC 是一种罕见、未分化、高度侵袭性的 TC 亚型，进展迅速，总体预后极差。PDTC 约占 3-5%，是高分化与未分化癌之间的过渡形式。新的 WHO 分类基于细胞起源、分子特征和分级对肿瘤进行重组，引入了新的高风险类别和低风险肿瘤分类。尽管多数甲状腺肿瘤病程惰性，但临床仍面临挑战，如区分良恶性结节、减少术前诊断不确定性、避免过度治疗，以及识别可能发展为侵袭性行为的患者。目前需要微创生物标志物来支持术前决策、指导个体化治疗强度等。在此背景下，基于 EV 的生物标志物因其能反映肿瘤来源的分子信息而备受关注。
**3. 细胞外囊泡**
细胞外囊泡（EVs）是小的、异质性的、由脂质双层包裹的纳米级颗粒，通过向受体细胞转移蛋白质、脂质、聚糖和核酸来介导细胞间通讯。EVs 的主要亚型包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。此外，还有迁移体、exophers、大囊泡以及非膜性的细胞外纳米颗粒。细胞外囊泡研究国际协会（ISEV）发布了最小信息指南（MISEV）以标准化实验设计和报告。本综述遵循 MISEV 指南，使用通用术语 EVs，并根据操作标准（如大小）进行分类。
**3.1. TC 来源 EVs 的分离**
已有多种 EV 分离方法，每种方法利用不同的物理化学性质。由于没有单一方法能同时实现高回收率、高纯度、可扩展性和完整性，方法选择取决于生物样本和下游应用。差速超速离心（DUC）是最常用的方法，但常共分离蛋白质和脂蛋白。密度梯度超速离心（DGUC）和尺寸排阻色谱法（SEC）通常提供更高纯度的制备物。聚合物沉淀法（PEG）快速廉价但特异性低。切向流过滤（TFF）便于大体积样本处理，免疫亲和捕获可富集疾病特异性 EV 群体。在 TC 研究中，选择分离策略尤为重要，因为半数研究分析血浆或血清，其中肿瘤来源的 EVs 仅占循环 EV 群体的一小部分。文献调查显示，超速离心和聚合物沉淀试剂盒仍是 TC 中的主要方法，较少使用 SEC、DGUC 或组合策略。结合多个分离流程被认为是最可靠的策略，而可扩展的方法如 TFF 或微流控平台更适合未来临床实施。
**3.2. TC EVs 的分子表征**
分离后，EVs 需要进行全面表征以验证其身份、评估纯度并定义其分子 cargo。根据 MISEV2023 指南，表征应包括膜相关蛋白、胞质蛋白和潜在非 EV 污染物的代表性标志物。小 EVs（sEVs）通常富含四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、ESCRT 相关蛋白（TSG101、Alix）和热休克蛋白，而较大的 EVs 则相对富含整合素、选择素和细胞骨架蛋白。EV 表征通常结合颗粒大小和浓度测量、形态学评估以及 EV 相关蛋白和核酸分析。文献调查显示，大多数 TC 研究依赖于 TEM/SEM、NTA 和蛋白质印迹法的组合，而先进的单颗粒和高分辨率分析技术仍很少使用。
**3.3. TC 来源 EVs 的分子 Cargo**
EV 的分子 cargo 介导亲代细胞与微环境之间的细胞间通讯。其 cargo 包括蛋白质、脂质以及多种核酸，如 mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、tRF、Y RNA、snoRNA 和 DNA。在 TC 中，EV 相关 miRNA 是目前研究最广泛的生物标志物类别，miR-146b-5p、miR-21-5p、miR-221/222 家族成员以及多 miRNA 组合在独立研究中显示出有前景的诊断和预后性能。EV 相关蛋白，如 PD-L1、甲状腺球蛋白（Tg）和半乳糖凝集素-3，也显示出有前景但验证较少的临床潜力。尽管异常糖基化在 TC 生物学中很重要，但研究 EV 糖基化或聚糖基生物标志物的研究仍然非常稀少。
**4. EVs 在 TC 发病机制中的作用**
EVs 的生物学功能主要由其分子 cargo 决定，通过水平转移生物活性 cargo 影响肿瘤微环境和远处转移部位的细胞过程。
**4.1. EV 介导的 TC 增殖和肿瘤生长**
肿瘤来源的 EVs 通过选择性运输致癌 cargo 促进肿瘤进展。早期研究确定了几种 lncRNA，如 CDKN2B-AS1，是 TC 细胞增殖和侵袭的关键介质。在临床层面，最强的证据涉及 EV 相关 miRNA 的生物标志物潜力，如 miR-146b-5p 和 miR-222-3p。EV 相关蛋白如膜联蛋白 A1（ANXA1）在体外和动物模型中显示出促进增殖和侵袭的作用，但主要基于临床前模型。
**4.2. EV 诱导的 TC 代谢重编程**
TC 进展的一个标志是 EV 诱导的代谢重编程。体外证据表明，TC 细胞释放的 EVs 可转移脂质介质，促进有氧糖酵解（Warburg 效应）。环状 RNA 如 CircPHGDH 和 circCCDC66 通过上调关键糖酵解酶或靶向代谢调节因子来促进肿瘤生长。在缺氧条件下，miR-210-3p 和 miR-221-3p 水平升高，促进增殖、迁移和侵袭。这些发现仍主要是机制性和基于模型的，需要患者样本和纵向队列的验证。
**4.3. TC 来源 EVs 在上皮间质转化和细胞外基质重塑中的作用**
上皮间质转化（EMT）是上皮细胞获得间质特性的过程。EVs 通过携带调节分子介导 TC 细胞与基质细胞之间的通讯。体外研究表明，TC EV 可将静止的成纤维细胞重编程为癌症相关成纤维细胞（CAFs），CAFs 反过来分泌富含促侵袭因子的 EVs，从而维持 EMT 和细胞外基质（ECM）降解。TC EVs 携带 CD147，与增加 MMP2 和 MMP9 的分泌或激活有关。EV 相关 miR-423-5p 被确定为 EMT 的关键调节因子，通过 circ0039411/miR-423-5p/SOX4/Wnt/β-catenin 轴发挥作用。癌症干细胞样细胞来源的 EVs 也通过转移 lncRNA 如 MALAT1 和 linc-ROR 来增强 EMT。这些发现主要基于临床前模型，临床证据主要是关联性的。
**4.4. TC 来源 EVs 在血管生成和淋巴管生成中的作用**
EVs 通过向内皮细胞递送促血管生成因子来促进新血管形成（血管生成）和淋巴管形成（淋巴管生成）。在 TC 中，缺氧的 PTC 细胞释放富含 miR-181a 的 EVs，促进内皮细胞增殖和管状网络形成，通过 miR-181a-MLL3/DACT2-YAP-VEGF 轴发挥作用。FGD5-AS1 和 miR-21-5p 也被证明能促进血管生成和血管通透性。这些发现主要来自体外和动物模型研究，临床证据有限。
**4.5. TC 来源 EVs 与免疫调节**
TC 来源的 EVs 是免疫调节的可能介质，通过递送免疫抑制分子如 PD-L1、半乳糖凝集素或 HMGB1 来促进免疫逃逸。HMGB1 激活 mTORC2-AKT-c-MYC 信号通路，增强 PD-L1 阳性 EVs 的产生。EV 递送的 PD-L1 直接与 T 细胞上的 PD-1 受体结合，抑制 CD8
+ T 细胞活化。EVs 还能调节巨噬细胞极化，如 miR-655-3p 抑制 M2 型巨噬细胞极化，而 miR-155 则促进促肿瘤表型。miR-519e-5p 通过下调 NOTCH2 导致 CD8
+ T 细胞耗竭。这些发现为免疫逃逸提供了生物学合理的框架，但证据等级仍偏向于临床前研究。
**4.6. TC 来源 EVs 与凋亡**
TC EVs 对凋亡具有双重作用：在肿瘤微环境中作为抗凋亡载体保护肿瘤细胞，同时在与免疫系统相互作用时作为促凋亡“弹头”选择性破坏免疫细胞。TC EVs 携带致癌 ncRNA（如 miR-21、miR-146b、miR-222），通过表观遗传抑制促凋亡肿瘤抑制因子（如 PTEN、Bax）来激活 PI3K/Akt/mTOR 生存通路。同时，它们通过呈现死亡配体（如 FasL、TRAIL）和 PD-L1 在脂质双层上，诱导细胞毒性 CD8
+ T 淋巴细胞和 NK 细胞凋亡。这些机制主要基于体外和动物模型研究，临床转化仍是主要瓶颈，目前尚无直接靶向 EV 介导凋亡的临床试验。
**4.7. TC 来源 EVs 在转移和侵袭中的作用**
EVs 通过携带生物分子来促进转移和侵袭，这些分子可准备转移前微环境并刺激血管生成。临床证据表明，miR-146b-5p 和 miR-222-3p 在伴有淋巴结转移（LNM）的 PTC 患者血清中高度富集。EV 相关 miR-21-5p 在缺氧条件下通过抑制 TGFBI 和 COL4A1 参与血管生成和内皮屏障破坏。EV 蛋白和 ncRNA 如骨膜素、BID 和 circRNA 被提议参与 ECM 重塑和侵袭行为。来自人牙髓干细胞（hDPSC）的 EVs 显示出抗转移潜力。这些发现为 EV 参与转移提供了生物学合理性，但临床证据仍主要是关联性的。
**4.8. TC 发病机制中的关键 EV 驱动通路**
现有证据集中在几个相互作用的通路上：EMT 和侵袭（Wnt/β-catenin、TGF-β/SMAD、SOX4、PAX6 等）；PI3K/AKT/mTOR 生存信号；缺氧和血管生成（miR-181a-MLL3/DACT2-YAP-VEGF、miR-21-5p/TGFBI-COL4A1）；代谢重编程（PKM2、PDK4、AKT）；ECM 重塑（CD147、MMP2、MMP9）；以及免疫逃逸（PD-L1、HMGB1-mTORC2/AKT/c-MYC、CD8
+ T 细胞耗竭、NK 细胞抑制、巨噬细胞极化）。这些通路表明 TC EVs 可能协调多种进展标志。然而，该领域存在显著局限性，包括 EV 分离方法差异大、患者队列规模小、机制研究依赖体外实验和动物模型，以及 TC 的生物学异质性。因此，EV 介导的机制应被视为生物学上合理但尚未临床确证。
**5. EVs 作为甲状腺癌的生物标志物**
EVs 的独特脂质双层保护其分子 cargo 免受循环中酶降解，从而保存甲状腺肿瘤生理状态的稳定指纹。因此，EVs 在 TC 中具有辅助诊断、预后评估和靶向治疗的生物标志物潜力。
**5.1. 血浆来源的 EV Cargo 作为生物标志物**
血浆来源的 EV 是 TC 中研究最广泛的生物标志物来源，尤其是 miRNA。
* 在诊断方面，多项研究证实血浆 EV miRNA 可用于区分良恶性甲状腺结节。例如，miR-5189-3p 显示出高诊断性能（AUC 0.951）；miR-146b-5p 和 miR-21a-5p 在 PTC 患者血浆 EV 中显著富集；一个由 miR-346、miR-10a-5p 和 miR-34a-5p 组成的三 miRNA 组合可有效区分 PTC 与结节性甲状腺肿；miR-16-2-3p、miR-223-5p 等可区分 PTC 与良性结节；一个五 miRNA 分类器（miR-127-3p、miR-223-5p 等）在区分 FTC 和 FTA 方面实现了高诊断准确性（AUC 0.844）。EpCAM 阳性的血浆小 EVs 被确定为敏感和特异的 TC 生物标志物。蛋白质如 KLK11、A1AG2、SMIM1 在恶性结节中上调。
* 在预后方面，miR-146b-5p 和 miR-222-3p 与 PTC 患者的 LNM 显著相关；miR-6774-3p 和 miR-6879-5p 升高与 LNM 相关；EV 相关 PD-L1 与肿瘤 T 分期相关。
* 在治疗方面，miR-1296-5p 与放射性碘难治性 PTC 相关；DOCK9-AS2 可能通过激活 Wnt/β-catenin 通路促进 PTC 进展。但治疗相关的证据仍有限。
**5.2. 血清来源的 EV Cargo 作为生物标志物**
血清和血浆 EVs 不可互换，血清 EV 分析需注意凝血相关的改变。
* 在诊断方面，血清 EV circRNA 谱（如 circ007293、circ031752、circ020135）与 PTC 相关；一个由 miR-25-3p、miR-296-5p 和 miR-92a-3p 组成的 miRNA 组合可准确区分 PTC 与良性甲状腺肿；miR-24-3p、miR-146a-5p 等可区分 PTC 患者与健康对照。RAB21 蛋白在 FTC 患者血清 EV 中高度富集。
* 在预后方面，miR-29a 在 PTC 患者中降低，较低水平与复发和较短的总体生存期相关；circ007293 通过 miR-653-5p/PAX6 通路驱动 EMT；BST2 蛋白水平升高与 PTMC 的 LNM 相关。
* 在治疗方面，miR-423-5p 具有生物标志物和治疗潜力，其沉默可抑制 TC 细胞迁移和侵袭；miR-17-5p 通过激活肺成纤维细胞中的促炎信号促进肺转移。
**5.3. 尿液来源的 EV Cargo 作为生物标志物**
尿液来源的 EVs 是 TC 中一种有前景的非侵入性生物标志物来源。研究发现，DTC 患者尿液中升高的 TIMP 和血管生成素-1 水平与 LNM 相关。术后稳定水平的尿液 EV 蛋白（如 Tg、半乳糖凝集素-3）与较低的复发风险相关。尿液 EV Tg 在血清 Tg 检测不到的患者中也可能增加，提示其可用于早期检测复发或残留疾病。
**5.4. 细胞系来源的 EV Cargo 与生物标志物发现**
细胞系来源的 EVs 为阐明 EV cargo 的分子组成和生物学功能提供了受控模型。
* 在诊断和预后方面，TPC-1 细胞 EVs 富集 miR-146b 和 miR-222；K1 细胞 EVs 中 miR-31-5p、miR-222-3p 和 let-7i-3p 与更侵袭性表型相关；缺氧条件下 PTC 细胞释放富含 miR-181a 的 EVs；EV 相关 lncRNA 如 FGD5-AS1、CDKN2B-AS1、SNHG9 与肿瘤进展相关；蛋白质如 ANXA1 被发现能促进肿瘤进展。
* 在治疗方面，EV 相关 lncRNA linc-ROR 的抑制可减弱侵袭性；MAPK 通路抑制可改变 EV 释放；vandetanib 治疗在 ATC 模型中产生独特的 EV 相关 RNA 特征；Hsp90 抑制剂可逆转 lenvatinib 耐药细胞中糖酵解相关 lncRNA 的表达变化。此外，EVs 可作为治疗递送载体，如递送 SCD-1 siRNA 或 CRISPR/Cas9 系统。
**5.5. 跨多种生物来源的 EV 生物标志物**
对跨多种生物来源（如细胞系、FNA 标本、血清、血清 EV）的 EV cargo 进行分析，有助于识别更具可重复性和临床相关性的生物标志物。例如，miR-145 在肿瘤细胞中表达降低，但在 TC 患者循环和 EV 中水平升高，且对不确定的 FNA 样本具有高阴性预测值。miR-519e-5p 通过调节 CD8
+ T 细胞功能促进远处转移。DOCK9-AS2 在 PTC 组织和血浆 EV 中均上调。多源验证对于区分稳健的生物标志物至关重要。
**6. 挑战与未来展望**
EVs 作为液体活检的生物标志物具有巨大潜力，但有望补充而非取代现有方法。成功临床转化需克服标准化、大规模临床验证和缺乏 TC 特异性 EV 标志物等挑战。未来进展将依赖于先进技术，如单 EV 分析、空间组学、微流控平台、多组学方法和人工智能辅助数据分析。EVs 作为治疗工具也具有吸引力，因其固有的生物相容性和低免疫原性，可用于递送治疗性分子。然而，商业化规模生产、剂量标准化、药代动力学/生物分布和安全性评估等关键问题仍需解决。目前，EVs 在 TC 中主要临床相关性在于生物标志物发现，用于微创疾病监测和高风险患者筛选。
