综述：苹果酒风味的进展：整合苹果原料、微生物生态和过程控制

《Microorganisms》：Advances in Cider Flavor: Integrating Apple Raw Materials, Microbial Ecology, and Process Control

　　

苹果酒（cider）是一种由苹果汁部分或完全发酵制成的低酒精果酒。近年来，其消费量显著增长，尤其在亚洲地区。其独特的风味特征反映了香气与非挥发性成分之间的复杂相互作用。苹果酒的组成主要受三个因素影响：原料、发酵剂和加工过程。本综述首先概述了苹果酒的组成，涵盖其芳香化合物和非挥发性成分。主要香气特征由高级醇、酯类、脂肪酸和羰基化合物定义，而糖类、有机酸和多酚则是其味道的关键决定因素。随后，本综述详细分析了原料、发酵剂的选择以及所应用的加工过程如何共同塑造苹果酒的风味。研究表明，苹果品种和成熟度影响糖类、有机酸和多酚的含量，从而奠定苹果酒的风味基础。为增强风味多样性，接种策略已从使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的单菌株发酵转向使用非酿酒酵母（non-Saccharomyces）和乳酸菌（lactic acid bacteria）的混合发酵，同时或顺序进行。目前，筛选非酿酒酵母菌株已成为增加苹果酒风味复杂性的关键策略。精确的微氧（micro-oxygenation）和营养供应调控微生物代谢，从而控制发酵过程和特定风味化合物的产生。未来，考虑到非酿酒酵母和乳酸菌在酿酒特性中尚未开发的多样性，该方向的研究可能是提升苹果酒质量的关键。此外，选择适合特定苹果酒风格的苹果品种，并探索冷浸渍（cold maceration）和酶解（enzymolysis）等发酵前处理，也可能有助于增强苹果酒的风味多样性。

1. 引言
苹果酒（cider）是世界第二大果酒类别，指通过苹果汁部分或完全发酵制成的工艺产品，包括添加其他水果的风味变体。其酒精含量较低，范围为1.2%至8.5%（v/v），市场定位为天然清爽饮料。欧洲国家如英国、爱尔兰、法国和西班牙有悠久的苹果酒生产传统，不同地区发展出独特的酿造风格。全球范围内，发酵苹果饮料有多种名称，如cider、cidre、sidre、sidra和apfelwein。在北美，“cider”通常指浑浊、未过滤和未巴氏杀菌的苹果汁，而发酵酒精产品特称为“hard cider”。苹果酒可基于生产技术和文化传统分为标准苹果酒（Standard Ciders）和特色苹果酒（Specialty Ciders）。全球苹果酒消费和生产正在增长，西欧占主导份额，但亚洲等新兴市场增长最快。尽管苹果酒发酵与葡萄酒酿造有相似之处，但苹果汁成分存在显著差异，如较高的果糖和L-苹果酸（L-malic acid）含量，以及较低的酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen）。当前研究主要关注苹果品种、发酵剂和发酵技术对苹果酒感官质量和功能特性的影响，其中非酿酒酵母（non-Saccharomyces）菌株的筛选是研究热点。本综述首先概述苹果酒的风味基础（非挥发性成分和香气成分）及相关代谢物的合成途径，然后总结苹果原料和发酵剂（非酿酒酵母和乳酸菌）对苹果酒风味的影响，并进一步介绍通过控制氧气和营养供应调控微生物代谢的研究进展。

2. 苹果酒的成分：风味的基础
苹果酒的成分主要由苹果汁决定，因此苹果品种、栽培条件、果实成熟度及物理或生物损伤均影响最终成分。此外，发酵过程及发酵过程中微生物的活性也起重要作用。主要成分包括水、碳水化合物、有机酸、多酚和挥发性香气化合物。

2.1 挥发性成分
果酒香气主要来源于三个途径：品种香气（原料固有的挥发性化合物）、发酵香气（发酵过程中形成的次级产物）和发酵后香气（陈酿过程中形成的独特混合物）。原料品种在很大程度上决定了酒体的香气轮廓，尤其在年轻果酒中。水果中的芳香化合物可能以游离形式直接贡献气味，但更常见的是以非挥发性、糖结合的前体形式存在。无味的糖苷作为香气前体积累，在果实成熟过程中主要位于果皮中。糖苷通过酸或酶水解（由植物、酵母或添加的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase））释放出气味活性的苷元。当这些苷元水平超过感知阈值时，成为活性香气成分。发酵过程中由酵母合成的挥发性化合物主要包括高级醇（赋予杂醇、杏仁和花香）、中长链挥发性酸（贡献脂肪、奶酪或汗味）、乙酸酯和乙酯（提供果香和花香）以及醛类（赋予黄油、果香或坚果风味）。此外，芳香物质可相互之间或与酒体中的其他分子（如氧气、蛋白质、多酚和多糖）相互作用，从而改变其感官影响。苹果酒中最重要的香气化合物是高级醇、酯类、脂肪酸、羰基化合物（醛和酮）和萜烯类。酵母中挥发性化合物的合成途径如图示：高级醇主要通过糖代谢的合成途径或氨基酸的分解代谢Ehrlich途径产生，其中中间α-酮酸的形成是关键步骤。在低酵母可同化氮培养基中，高级醇主要通过合成途径形成。苹果酒中主要的高级醇是2-苯乙醇（2-phenylethanol）和3-甲基-1-丁醇（3-methyl-1-butanol，异戊醇）。高级醇是酯类的前体，对果酒香气复杂性有积极贡献，但浓度超过300 mg/L时会产生强烈刺激性气味。醛类主要来源于苹果原料，经微生物发酵后醛类的种类和浓度均降低。脂肪酸，特别是乙酸、己酸、辛酸和癸酸，有助于形成新鲜香气。酯类主要分为乙酸酯和乙酯两类，通过酯化反应合成。在苹果酒中，酯类占挥发性化合物总品种的近50%，气味活性值（OAV）超过阈值的酯类主要包括乙酸酯（如乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯）和中链脂肪酸乙酯（如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯）。半挥发性有机化合物（SVOCs）对饮料香气的贡献日益受到关注，但相关研究相对有限。目前，通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合GC-MS已在苹果酒中鉴定出数百种挥发性化合物，但浓度普遍较低，且受原料、酵母菌株和发酵条件等因素显著影响。

2.2 非挥发性成分
糖类、有机酸和多酚对苹果酒的口感有显著贡献，它们相互作用形成整体口腔感受。糖类贡献甜味，果糖和山梨醇主要负责最终产品的甜味。有机酸定义苹果酒的口感轮廓，并直接影响甜味的感知；酸度正面感知与产品的新鲜度相关。多酚主要影响产品的苦味、涩味和颜色。表儿茶素（epicatechin）、儿茶素（catechin）和原花青素（procyanidins）等贡献苦味，而酚酸如香豆酸（coumaric acid）、没食子酸（gallic acid）和原儿茶酸（protocatechuic acid）负责涩味。原花青素（proanthocyanidins）显著贡献酒体的涩口感，聚合度越高，酒体的苦味和涩味越强。苹果酒中糖含量：果糖（3.0–32.9 g/L）、山梨醇（3.1–14.1 g/L）、葡萄糖（0.1–20.8 g/L）、蔗糖（0.1–11.8 g/L）；有机酸含量：苹果酸（0.37–2.9 g/L）、柠檬酸（0.0–2.8 g/L）、L-乳酸（0.04–4.35 g/L）。通常苹果酒中酚类化合物含量低于相应苹果汁。苹果酒中的酚类化合物分为五类：（1）黄烷-3-醇（flavan-3-ols），包括(+)-儿茶素、(?)-表儿茶素及其聚合物，含量2–5 g/kg；（2）羟基肉桂酸（hydroxycinnamic acids），包括咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸及其酯类（如绿原酸、5-咖啡酰奎宁酸），含量0.3–2.5 g/kg；（3）二氢查尔酮（dihydrochalcones），包括根皮苷、根皮素等，含量0.02–0.10 g/kg；（4）黄酮醇（flavonols）；（5）微量花青素（anthocyanins）。黄酮类化合物（114.81–253.44 mg/L）是苹果酒中第二丰富的酚类化合物，仅次于羟基肉桂酸（141.47–327.44 mg/L）。儿茶素（8.13 mg/L）等是主要单体酚类化合物。与挥发性成分相比，对苹果酒中非挥发性成分的研究仍相对有限，当前研究多采用非靶向代谢组学进行测量，化合物鉴定主要依赖现有数据库，定量验证不足。

3. 影响苹果酒风味轮廓的因素

3.1 苹果原料：品种和成熟度
根据苹果酸和单宁含量，苹果可分为甜型、苦甜型、苦酸型和酸型四类。富士是世界上栽培最广泛的苹果品种。苹果酒生产原料主要包括鲜苹果、脱水苹果、苹果汁（果浆）和浓缩苹果汁。通常，苹果酒生产商更偏好特定苹果品种而非鲜食苹果，以生产出酸度、甜度、涩度和苦味平衡的高品质苹果酒。苹果汁主要由水（80–90%）组成，还含有多种可溶性化合物。糖类占主要可溶性成分（约75–90%），果糖是主要糖类。苹果酸（1–10 g/L）是苹果汁中主要的有机酸，占总酸度约85%，与柠檬酸和奎宁酸一起占有机酸总量的95.57%。氨基酸是酵母的主要氮源，也是关键挥发性化合物（尤其是高级醇和酯类）的前体，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和丝氨酸合计占总氨基酸的80%以上。苹果汁中氨基酸缺乏可导致发酵缓慢和香气产量降低，当可同化氮浓度低于75 mg/L时可能发生发酵停滞。不同苹果品种在有机酸、多酚、磷酸盐、矿物质和微量元素含量上存在显著差异。苹果多酚的主要成分包括绿原酸、根皮苷、原花青素、表儿茶素、花青素和黄酮类化合物，与健康功效密切相关。苹果多酚的种类和浓度因品种和生长阶段而异。典型鲜食苹果（红富士）制成的苹果酒中酚类化合物含量高于其他品种，但主要感官差异来源于苹果品种本身。苹果原料的成熟度显著影响其组成轮廓：随着成熟度增加，糖含量升高而酸度降低；不同成熟度苹果的可溶性固形物含量范围为8.0–18.9 °Brix，苹果酸含量在0.13–17.2 g/L之间。未成熟苹果中酚类化合物含量高于成熟或过熟苹果，相应苹果酒也呈现相同趋势。苹果成熟度还影响挥发性化合物组成，过熟苹果制成的苹果酒中挥发性化合物（如高级醇和乙酸酯）含量高于未成熟果实。不同苹果品种之间酚类含量也存在显著差异。

3.2 发酵剂：从自然发酵到合成微生物群落
果酒发酵主要由来源于原料、酒厂环境或设备，或接种的微生物驱动。酵母在苹果酒发酵中起决定性作用。传统苹果酒通过自然发酵由本土酵母生产，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在未发酵果汁中通常不存在或含量极低，但在自然发酵中迅速占据主导完成酒精转化。为加速发酵并减少感官偏差，常向苹果汁中接种发酵剂。酿酒酵母因其强大的发酵能力、高耐受性和可预测的风味化合物生产，被认为是苹果酒生产的传统商业酵母。在自然发酵过程中，酵母群落动态变化显示：早期阶段汉逊酵母属（Hanseniaspora）和梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）增殖，中期酿酒酵母（S. bayanus）占主导，后期酿酒酵母（S. cerevisiae）成为优势酵母。接种发酵改变了苹果酒的微生物组成，抑制其他酵母但增加细菌多样性。不同酵母菌株主要影响花青素和黄酮类化合物轮廓。然而，仅依赖酿酒酵母的单一菌株发酵常导致香气轮廓有限，限制了苹果酒的整体感官复杂性。混合发酵被广泛研究以克服单一菌株接种的局限性。非酿酒酵母（non-Saccharomyces）在新鲜压榨果汁中自然占主导，但历史上被视为腐败微生物。目前研究证明，非酿酒酵母（如德尔布有孢圆酵母Torulaspora delbrueckii、克鲁维酵母Pichia kluyveri、汉逊酵母Hanseniaspora uvarum、异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus和梅奇酵母Metschnikowia pulcherrima）具有优良的果酒发酵酿酒特性，包括释放对最终酒体感官复杂性有积极贡献的风味和香气化合物。酵母中乙酰辅酶A（acetyl-CoA）是中心碳代谢的关键中间代谢物，不同酵母菌株风味化合物产量的差异主要源于酶系统的差异。例如，戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）以低产乙酸和乙醇、高产甘油、果酯、硫醇和萜烯为特征；粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可降低苹果酸含量和酸度；马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）可产生高水平的乙酸乙酯。然而，非酿酒酵母对乙醇敏感，且苹果汁中可同化氮浓度低，导致部分非酿酒酵母无法独立完成酒精发酵。为确保可靠发酵同时增强感官轮廓，研究人员采用非酿酒酵母与酿酒酵母的混合发酵。顺序接种（sequential inoculation）是一种有效策略，可优化酿酒酵母与非酿酒酵母之间的协同效应，使非酿酒酵母在酿酒酵母主导乙醇生产前建立代谢活性。苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）显著影响果酒的香气复杂性，通过将主要酸苹果酸脱羧为乳酸，并增加黄酮类化合物含量。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是MLF的主要执行者，常用菌种包括酒酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，现重新分类为Lactiplantibacillus plantarum）。植物乳杆菌与酿酒酵母的共发酵可增加苹果酒中乙酸乙酯和异戊醇的含量，并显著增强抗氧化能力。

3.3 过程精确控制：氧气和营养
发酵过程中的氧气和添加剂（营养）共同改变苹果酒的化学轮廓，最终塑造其感官特性。氧气在酿造和陈酿过程中发挥双重作用。发酵期间，氧气主要通过调节酵母活性影响酒体成分；陈酿期间，微氧技术（micro-oxygenation, MOX）促进氧化、酯化、聚合和缩合等系列反应，显著增强酒体的复杂性和深度。在低脂条件下，氧气补充诱导酵母生物合成麦角固醇和不饱和脂肪酸，促进氮同化。然而，过量氧气会导致酚类氧化、单宁涩味增加、新鲜度丧失和香气氧化等负面结果。常见的缓解策略是使用二氧化硫（SO₂），添加50 mg/L SO₂可将多酚氧化酶活性降低75–90%。微氧技术是一种创新技术，通过精确控制氧气传递速率和量，在较短时间内实现类似传统长期陈酿的效果。近期降低果酒酒精含量的策略涉及使用有氧条件使糖进行呼吸-发酵代谢，非酿酒酵母菌株被用于克服酿酒酵母Crabtree阳性特性的限制。营养缺乏，特别是氮和维生素缺乏，与发酵停滞或缓慢相关。因此，有时向未发酵果汁中添加外部营养以避免此类问题。可同化氮不仅对酵母生物量至关重要，还对芳香化合物的合成起关键作用。不足的水平会导致发酵缓慢或停滞，并促进不良挥发性硫化氢的形成。补充60 mg N/L的磷酸氢二铵可显著增加苹果酒中挥发性化合物含量，特别是中链脂肪酸乙酯和脂肪酸；添加150 mg N/L的氨基酸可显著提高高级醇和乙酸酯的浓度。酵母衍生物广泛用于酿酒过程中的发酵管理和酒体稳定，提供可同化氮，刺激酵母和乳酸菌生长，防止发酵停滞，并通过酵母甘露蛋白的作用增强胶体稳定性。

4. 结论与展望
本综述系统阐明，苹果酒的最终风味轮廓是原料、发酵微生物和过程控制三个主要因素复杂相互作用的直接结果。苹果品种通过其特定的糖酸比和多酚轮廓奠定风味基础；发酵剂，特别是从纯酿酒酵母发酵向涉及多种非酿酒酵母的同时或顺序接种的战略转变，已成为塑造香气复杂性的核心驱动力；乳酸菌驱动的苹果酸-乳酸发酵（MLF）也在塑造苹果酒风味中起关键作用。精确控制氧气管理和营养供应等关键参数对确保顺利发酵和提升感官质量至关重要。未来研究展望围绕上述三个关键因素展开：原料方面，尽管有大量苹果品种可供选择，但最适合酿造苹果酒的品种仍不明确，应聚焦于为不同苹果酒风格筛选特定品种，并标准化苹果原料加工流程。发酵剂方面，尽管非酿酒酵母的使用正成为苹果酒发酵的趋势，但在相对厌氧条件下单独完成酒精发酵仍具挑战，限制了其商业应用；鉴于其Crabtree阴性特性，应用微氧和营养补充以改善其发酵动力学可能是有前景的方向。此外，苹果酸-乳酸发酵（MLF）研究值得进一步探索，除酒酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）外，应筛选更多适应苹果酒环境且能与酵母共发酵的乳酸菌菌株。过程控制方面，除了调节微生物代谢外，还应研究冷浸渍（cold maceration）和酶解（enzymolysis）等发酵前处理，以增强苹果中可溶性成分的提取，从而改善苹果酒的风味和功能特性。