《Plants》：Association Mapping of Seedling Resistance to Fusarium graminearum Root Rot and Development of KASP Assays in Soybean
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由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的大豆根腐病是一种重要的土传病害，阻碍幼苗建成并最终降低大豆产量，因此抗病种质与可靠的分子标记对抗病育种十分必要。研究人员利用病情指数（DSI）对336份大豆种质进行禾谷镰刀菌根腐病抗性评估，DSI在
由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的大豆根腐病是一种重要的土传病害，阻碍幼苗建成并最终降低大豆产量，因此抗病种质与可靠的分子标记对抗病育种十分必要。研究人员利用病情指数（DSI）对336份大豆种质进行禾谷镰刀菌根腐病抗性评估，DSI在关联群体中介于5.71至100.00之间。基于重测序获得的单核苷酸多态性（SNP）数据，采用混合线性模型（MLM）与固定和随机模型循环概率统一（FarmCPU）模型开展全基因组关联分析，分别检测到117和113个候选抗性关联SNP，其中105个共有SNP用于界定候选基因组区间，区间内含247个注释基因。结合基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集、功能注释及等位效应分析，优先选出6个候选基因及其外显子SNP。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）显示6个候选基因均呈侵染响应表达，其中Glyma.17g202500与Glyma.18g266700在抗性等位材料中诱导更强。研究人员将这两基因中的2个SNP转化为竞争性等位特异性PCR（KASP）检测，成功建立KASP-S17_32244510与KASP-S18_55105706用于基因型筛查，筛查效率分别为73.08%与74.29%。上述结果确定了有用的遗传靶点与分子标记，可用于改良大豆对禾谷镰刀菌根腐病的抗性。
研究背景方面，大豆是全球重要的植物蛋白与食用油来源，而禾谷镰刀菌引起的根腐病在温带玉米-大豆轮作区尤为突出，黑龙江等地发病率达75%至90%，年减产约10%至20%。化学种衣剂与轮作防控效果有限，且可能筛选耐药病原群体，因此挖掘自然变异中的抗性位点并开发稳定可扩展的分子标记成为抗病育种的关键瓶颈。此前连锁作图已定位到染色体6、8、13、15、16、19上的数量性状位点（QTL），其中qRfg_Gm06被精细定位至约400 kb区间并开发了KASP标记，但多样种质中可用的禾谷镰刀菌根腐病（FGRR）抗性标记仍十分有限，且不同研究间因种群背景、病原分离物与评价体系差异而检出位点不完全一致，亟需在自然群体中以多模型交叉验证补充新位点。
主要关键技术方法方面，研究人员以东北农业大学大豆研究所提供的336份大豆种质（以中国地方品种与育成品种为主，含少量国外材料）为关联群体，于温室采用小麦粒扩繁的禾谷镰刀菌L09分离物接种幼苗，播后10天按0至7级标准评根腐症状并计算DSI；利用实验室既往重测序SNP经MAF<0.05与缺失率>10%过滤后保留1,329,617个高质量SNP，在R语言GAPIT 3.0中分别以MLM与FarmCPU双模型做全基因组关联分析，取?log10(P)≥4.0为 suggestive 阈值并取两模型共有SNP；以共有SNP为中心向两侧各延100 kb提取候选区间基因（Wm82.a2.v1注释），做GO/KEGG富集、等位效应t检验、抗感材料（HN531与KN1）接种后72 h根组织qRT-PCR；选2个外显子SNP设计KASP引物（等位特异正向+通用反向，FAM/HEX双色）在ABI 7500上分型，以DSI≤40为抗性标准算筛查效率，并对两位点做线性回归看主效与互作。
研究结果部分，2.1 表型变异中，336份材料DSI均值44.93±16.91，呈连续近单峰分布，无免疫材料，高抗（HR）占5.06%、抗病（R）35.42%、感病（S）56.85%、高感（HS）2.68%，具备关联分析所需广度。2.2 全基因组关联分析中，MLM检117个SNP（8条染色体）、FarmCPU检113个（6条染色体），105个为共有，主峰在17号染色体，次峰在3、7、9、12、18号，未见6号qRfg_Gm06信号，说明本群体补充了新位点。2.3 候选区间功能注释中，247个非冗余基因GO富集于异黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢、膜转运与甲基化，KEGG涉及异黄酮与谷胱甘肽代谢、蛋白酶体、同源重组及植物-病原互作，按SNP位置+等位效应+防御注释筛出6个候选：Glyma.09g168300、Glyma.12g220200、Glyma.17g202000、Glyma.17g202500、Glyma.18g033900、Glyma.18g266700。2.4 外显子SNP等位效应中，6个SNP等位类DSI差异显著，有利等位为S09_39290818-C、S12_37955440-G、S17_32166476-A、S17_32244510-T、S18_2618132-G、S18_55105706-G，携带有利等位者DSI降低6.66至14.07，以S18_55105706（降14.07）与S17_32244510（降12.78）效应最大。2.5 转录响应中，接种72 h后6基因均诱导，Glyma.12g220200、Glyma.17g202500、Glyma.18g266700在抗病材料HN531诱导强于感病KN1，Glyma.09g168300反在KN1更高，Glyma.17g202500与Glyma.18g266700抗感差异最明显。2.6 KASP开发与评价中，选S17_32244510与S18_55105706转为KASP-S17_32244510（C/T）与KASP-S18_55105706（A/G），分型簇分离清晰；TT基因型26份中19份DSI≤40（效率73.08%），GG基因型35份中26份DSI≤40（效率74.29%），均高于群体整体抗病比例；308份双位点纯合材料中CC/AA、TT/AA、CC/GG、TT/GG均值DSI为47.21、37.41、35.21、9.98，TT/GG最低但仅4份，回归显示两位点主效显著、互作不显著（p=0.095）。
讨论部分总结，研究人员指出FGRR抗性是多基因控制的数量性状，本群体DSI连续分布与前人一致；双模型交叉提升位点置信度，主信号落12、17、18号染色体，未重复6号qRfg_Gm06可能因等位频率与背景差异，自然群体GWAS与双亲群体连锁作图互补；Glyma.17g202500与Glyma.18g266700经等位效应+qRT-PCR双重支持，可能涉及异黄酮/谷胱甘肽代谢与病原互作；KASP标记成本低、通量高，73%以上筛查效率优于群体基线，可作抗源初筛工具，TT/GG组合提示累加优势但需扩大验证。结论部分翻译为：本研究对336份大豆种质的禾谷镰刀菌根腐病苗期抗性进行评定，DSI呈连续分布且表型变异广；MLM与FarmCPU共检出多染色体抗性信号，105个共有SNP界定区间获247个注释基因；结合富集、等位效应、注释与表达响应优先6个含外显子SNP候选基因，Glyma.17g202500与Glyma.18g266700有利等位关联更低DSI且在抗病材料诱导更强；两基因SNP转为KASP-S17_32244510与KASP-S18_55105706，筛查效率73.08%与74.29%，为大豆禾谷镰刀菌根腐病标记辅助筛查提供了候选基因资源与分子标记。论文发表于《Plants》。
