针对中国流行性结节性皮肤病病毒株和山羊痘病毒株的差异检测的双重TaqMan-MGB qPCR检测方法的开发

《Animals》：Development of a Duplex TaqMan-MGB qPCR Assay for Differential Detection of Chinese Epidemic Lumpy Skin Disease Virus Strains and Goatpox Virus

　　

结节性皮肤病（LSD）是一种跨界病毒性疾病，影响牛（包括亚洲水牛和牦牛）以及某些野生反刍动物（如非洲水牛、长颈鹿、角马、大羚羊和阿拉伯大羚羊）。该病由结节性皮肤病病毒（LSDV）引起，该病毒与山羊痘病毒（GTPV）和绵羊痘病毒（SPPV）同属于羊痘病毒属（Capripoxvirus，痘病毒科Poxviridae）。这些病毒之间高度的核苷酸同一性和血清学交叉反应阻碍了差异诊断。本研究旨在开发一种双重TaqMan-MGB qPCR检测方法，用于差异检测中国流行性结节性皮肤病病毒株和山羊痘病毒。研究人员开发了一种靶向LSDV GPCR和GTPV RPO30基因座的双重TaqMan-MGB实时定量PCR（qPCR）检测方法。设计了病毒特异性引物和MGB探针，并对反应进行优化以实现单管双靶标检测。该检测方法无交叉扩增，检测限为1×10¹ copies/μL（LSDV）和1×10¹ copies/μL（GTPV），变异系数<1%。将该方法应用于来自青藏高原的175份牦牛来源田间样本，分别检出16份和36份LSDV阳性及GTPV阳性样本。LSDV和GTPV阳性样本分别在FAM和VIC通道显示特异性扩增。双重格式能够同时检测并明确区分LSDV和GTPV，且适用于高通量筛查。这种灵敏、特异且可重复的检测方法支持LSD在流行区和风险区的监测与控制。

**研究背景与问题**
结节性皮肤病（Lumpy Skin Disease，LSD）是一种由结节性皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus，LSDV）引起的急性、亚急性或慢性传染病，主要影响牛、亚洲水牛和牦牛，以及某些野生反刍动物。LSDV与山羊痘病毒（Goatpox Virus，GTPV）和绵羊痘病毒（Sheeppox Virus，SPPV）同属羊痘病毒属（Capripoxvirus，痘病毒科Poxviridae），三者核苷酸序列同一性>96%，且诱导交叉反应抗体，导致血清学方法无法区分感染。LSD于2019年首次在中国新疆报道，随后扩散至14个省份/地区，并于2021年10月首次在牦牛及牦牛?牛杂交个体中检出，标志着该病侵入此前被认为风险较低的高海拔牧区。在中国，官方推荐使用减毒活GTPV疫苗预防LSD，但疫苗接种后的皮肤反应（如稀疏结节）与自然感染临床表现难以区分。此外，当前中国流行的LSDV株主要属于一个重组谱系，与经典外国株存在遗传差异，而活减毒GTPV疫苗的广泛使用使得区分中国流行LSDV株与GTPV对疫情调查、疫苗监测和流行病学监测尤为重要。因此，开展本研究旨在开发并评估一种双重TaqMan-MGB qPCR检测方法，靶向LSDV的GPCR基因和GTPV的RPO30基因区域，用于差异检测中国流行LSDV株和GTPV。该研究具有重要的公共卫生和畜牧业经济意义，论文发表在《Animals》。

**主要技术方法**
研究人员设计并合成了针对LSDV GPCR和GTPV RPO30基因区域的病毒特异性引物和MGB探针，构建了pUC57-LSDV和pUC57-GTPV质粒标准品。通过优化退火温度（52–58°C）及引物/探针浓度（0.10–0.20 μM），确定了最佳反应条件。利用10倍梯度稀释的质粒标准品建立标准曲线，评估线性关系和扩增效率。通过检测一组非靶标病原体（包括PPRV、BRV、BVDV、BCoV、orf病毒、BHV-1及细菌）评估分析特异性，通过8次重复实验确定检测限（Limit of Detection，LOD），并通过3次独立运行（每次3个浓度各3重复）评估批内和批间重现性。临床样本共175份牦牛来源的田间样本，包括EDTA抗凝全血、肌肉和皮肤组织，采集自2011–2024年间西藏、四川、青海和甘肃的个体牦牛，存储于-80°C待检。

**研究结果**
**3.1 双重TaqMan-MGB qPCR条件的优化**
通过评估52–58°C的退火温度和0.10–0.20 μM的引物/探针浓度，研究人员确定58°C为最佳退火温度（产生最低Ct值和最强荧光信号）；优化后20 μL反应体系包括：10.0 μL AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2，0.3 μL各GTPV上下游引物，0.4 μL各LSDV上下游引物，0.4 μL各GTPV和LSDV探针，2.0 μL DNA模板，ddH₂O补足至20.0 μL。

**3.2 标准曲线的建立**
使用1.0×10⁹至1.0×10⁰ copies/μL的质粒标准品构建标准曲线，Ct值与log₁₀(拷贝数)呈良好线性关系：LSDV的R²=0.998，GTPV的R²=0.9997；扩增效率分别为106.8%（LSDV）和107.6%（GTPV）。

**3.3 分析特异性**
仅LSDV和GTPV阳性对照产生靶标特异性扩增，所有非靶标病原体及无模板对照均无扩增，表明该检测方法具有高分析特异性。

**3.4 分析灵敏度**
对混合质粒DNA的10倍梯度稀释液进行检测，LSDV和GTPV均显示清晰S形扩增曲线，检测限（LOD）均为1.0×10¹ copies/μL。

**3.5 重现性**
在1×10⁶至1×10⁴ copies/μL浓度范围内，批内变异系数（CV）为0.38%–0.66%，批间CV为0.10%–0.81%，均低于2%，表明检测方法重现性优异。

**3.6 临床样本检测**
对175份青藏高原地区（西藏/青海/四川/甘肃）牦牛田间样本进行检测，分别检出16份LSDV阳性和36份GTPV阳性，其中4份为双阳性。按采样时间分层：所有16份LSDV阳性样本均采集于2019–2024年；GTPV阳性样本在2019年前（3/102）和2019–2024年（33/73）均有检出。对5批次减毒GTPV疫苗株AV41的核酸检测均呈GTPV阳性，而LSDV Neethling株无扩增，证实了该检测方法对LSDV中国流行株的谱系选择性设计。

**讨论与结论**
讨论部分指出，中国LSD自2019年首次报道以来呈多灶性散发态势，牦牛感染后出现皮肤黏膜结节病变及高热，导致高死亡率，严重威胁青藏高原牦牛养殖业的可持续性。由于GTPV、SPPV与LSDV在基因组和抗原水平高度相似，许多国家在缺乏同源LSDV疫苗时使用异源活减毒GTPV或SPPV疫苗，但接种后可能出现类似轻度自然LSD的短暂反应，且血清学无法区分感染与疫苗接种。在中国，活减毒山羊痘疫苗接种已用于LSD暴发，同时疫苗重组LSDV亚支也已出现，因此需要一种谱系特异性分子方法区分田间感染与疫苗相关信号，并区分中国流行LSDV株与国外谱系及GTPV。本研究开发的TaqMan-MGB探针双重qPCR检测方法，相比传统水解探针，MGB探针提供更高灵敏度和增强的错配区分能力，可实现单核苷酸分辨率。通过靶向GPCR基因的C/T和C/A单核苷酸多态性（SNP）区分中国流行LSDV株与外国株，同时靶向RPO30基因的G→A多态性区分GTPV。与已有qPCR检测方法（如Wu等人、Yao等人、Yu等人、Nie等人的研究）相比，本方法在单管中同时检测GTPV和中国流行LSDV株，并实现谱系特异性区分，具有更低的检测限或更全面的靶标覆盖。研究局限性包括：未对SPPV进行实验验证，未纳入内源性内参，部分临床阳性样本未经测序或独立方法确认，且检测方法仅针对中国循环LSDV株而非所有谱系。未来需使用更全面的羊痘病毒分离株、引入内参并扩大地理区域样本进行进一步诊断验证。
**结论**：研究人员开发了一种高度灵敏且特异的双重TaqMan-MGB qPCR检测方法，可同时检测GTPV和中国循环LSDV株。重要的是，该方法能区分中国循环LSDV株与外国谱系，并明确区分LSDV与GTPV，解决了现有分子诊断方法的关键局限性。经进一步验证，该双重TaqMan-MGB qPCR检测方法可为早期诊断、快速大规模筛查和流行病学监测提供有用工具。