《Biochimie》：Mechanistic insights into the neuroprotective effects of monoterpene-rich
Eucalyptus citriodora essential oil: integrated
in silico and
in vitro analysis in 6-OHDA-treated N2a neuronal cells
编辑推荐：
•柠檬桉精油主要由含氧单萜主导，主要是香叶醛、异胡薄荷醇和香叶醇。•ECEO 保护 N2a 神经细胞免受 6-OHDA 诱导的细胞毒性。•ECEO 减少氧化/亚硝化应激、乳酸脱氢酶渗漏和线粒体去极化。•蛋白质组学揭示了 PSMB4、TUBB5、PHB1、NDUFS3、PKM、
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柠檬桉精油主要由含氧单萜主导，主要是香叶醛、异胡薄荷醇和香叶醇。
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ECEO 保护 N2a 神经细胞免受 6-OHDA 诱导的细胞毒性。
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ECEO 减少氧化/亚硝化应激、乳酸脱氢酶渗漏和线粒体去极化。
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蛋白质组学揭示了 PSMB4、TUBB5、PHB1、NDUFS3、PKM、PGK1 和 SUCLG2 的调节。
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ECEO 可能作为一种源自植物的多靶点神经保护候选药物，与年龄相关的神经退行性变有关。
引言
帕金森病（PD）影响全球超过 1100 万人，且仍然缺乏疾病修饰治疗 [1]。其病理标志，即黑质致密部进行性多巴胺能退行性变和路易小体中错误折叠的α-突触核蛋白积累，源于蛋白质稳态失调、线粒体功能障碍和氧化应激的汇聚 [2]，[3]。尽管多巴胺能疗法提供了有意义的症状缓解，但它们无法阻止神经退行性变，并与长期并发症有关，包括运动波动和治疗抵抗 [2]，[4]。即使是高级干预策略，如深部脑刺激，也存在固有的手术风险，且不能解决潜在的神经退行性过程 [5]。这种持续的治疗差距加剧了对针对神经退行性变启动和进展的分子机制的疾病修饰化合物的搜索。
泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）的损伤和线粒体功能障碍现在被认为是 PD 发病机制中早期、核心事件。未能清除错误折叠的蛋白质促进了有毒物种的积累，触发内质网（ER）应激并在自我强化级联中放大氧化损伤，从而加速多巴胺能细胞死亡 [3]，[6]，[7]。线粒体功能障碍进一步加剧了这种脆弱性：呼吸链的损伤放大了活性氧（ROS）的产生并导致能量崩溃 [8]，[9]。因此，同时参与蛋白质稳态、线粒体完整性和氧化还原稳态的试剂可能比单靶点策略提供更好的治疗价值。
在衰老和年龄相关神经退行性疾病背景下，人们越来越关注作为营养和营养医药策略一部分的源自植物的生物活性化合物 [10]，[11]。这些化合物可能通过调节氧化应激、炎症、线粒体功能和蛋白质质量来支持细胞韧性 [12]，[13]，[14]，[15]。精油（EOs）是挥发性植物代谢物的复杂混合物，作为多靶点神经保护候选药物引起了越来越多的兴趣。它们的亲脂性萜类成分可以穿过血脑屏障并与多个分子靶标相互作用，包括抗氧化系统和炎症介质 [16]，[17]，[18]。临床前证据越来越多地表明，来自不同芳香物种的精油可以减轻神经退行性变中的关键致病过程。精油混合物中多种成分之间的协同相互作用可能会放大保护效力，超越单一化合物的效果，这一特性对于像 PD 这样复杂、多因素的疾病尤为相关 [17]。
在精油成分中，单萜因其分子量小、亲脂性、膜通透性和广泛的生物活性而引起了越来越多的兴趣。据报道，几种单萜和含氧单萜在细胞应激和神经退行性变的实验模型中显示出抗氧化、抗炎、线粒体调节或细胞保护特性 [19]，[20]，[21]。此外，不同精油成分之间的协同或加性相互作用可能会放大生物活性，超越分离化合物的活性 [22]，[23]，[24]。因此，富含单萜的精油代表了用于研究年龄相关神经退行性疾病多轴神经保护的有前景的源自植物的生物活性混合物。
柠檬桉（Eucalyptus citriodora Hook.）（桃金娘科）俗称柠檬桉树，原产于澳大利亚。如今，由于其生长迅速和广泛的适用性，它被广泛种植在世界各地的热带和亚热带地区 [25]，[26]。从其叶片中提取的精油用于香水、制药和相关行业 [27]。此外，桉树油被公认为无毒，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）授予的“一般认为安全”（GRAS）状态 [28]。除了其工业价值外，ECEO 因其显著的抗菌、抗氧化和抗炎特性而引起了越来越多的科学兴趣，这主要归因于其高单萜含量 [29]，[30]。 然而，化学成分和由此产生的生物活性可能会根据地理来源、提取方法和收获季节等因素而变化 [31]，[32]。
柠檬桉的神经保护潜力开始显现。据报道，用其叶片提取物进行饮食补充可改善 PD 转基因黑腹果蝇模型的运动功能，这种效果可能由其抗氧化和抗炎特性介导 [33]。然而，ECEO 介导的神经保护的分子机制，特别是那些与线粒体稳态、蛋白质稳态和细胞骨架完整性相关的机制，尚不清楚。6-羟基多巴胺（6-OHDA）模型被广泛用于重现多巴胺能神经毒性的关键特征，包括氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡。因此，它代表了一个合适的实验系统，用于评估 ECEO 是否能够抵消 PD 相关的细胞损伤。
因此，本研究选择 ECEO 是基于其化学和生物学相关性。我们的 GC-MS 分析显示，ECEO 主要由含氧单萜主导，主要是香叶醛、异胡薄荷醇和香叶醇。这些主要成分被选用于计算机模拟药代动力学、毒性和靶标预测分析，因为它们代表了精油的主要化学特征，并可能对其生物活性有贡献。重要的是，ECEO 的成分和生物活性可能会根据地理来源、提取方法、收获季节和储存条件而变化 [31]，[32]，这强调了在解释其生物效应之前对所用精油进行化学表征的必要性。
因此，本研究旨在确定富含单萜的 ECEO 是否保护 N2a 神经细胞免受 6-OHDA 诱导的神经毒性，并识别与此保护相关的分子机制。为此，我们首先表征了 ECEO 的化学成分，这是通过气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）确定的，随后对其主要成分进行了计算机模拟药代动力学、安全性和靶标谱评估。最后，我们评估了 ECEO 对细胞活力、膜完整性、ROS 和 NO 产生以及线粒体膜电位的影响。最后，使用定量 2-DE/MALDI-TOF/TOF 蛋白质组学，结合通路和蛋白质 - 蛋白质相互作用分析，来确定 ECEO 在 6-OHDA 模型中调节的主要细胞通路。
章节片段
试剂
柠檬桉精油购自 Aroma-Zone（法国巴黎；批号：[待完成]），这是一家天然产品商业供应商，包括化学类型鉴定、100% 纯精油。它通常储存在琥珀色玻璃瓶 4°C 中直至使用。用于机制实验的工作稀释度，1:4000 v/v，对应于每 mL 培养基中 0.25 μL 的 ECEO。基于供应商指示的密度（0.86 g/mL）和 GC-MS 相对峰面积，
柠檬桉精油的化学表征
ECEO 的 GC–MS 分析鉴定出 22 种挥发性化合物，它们共同占精油总组成的约 90%（图 1，表 1）。该精油由含氧单萜主导，香叶醛为主要成分（60.7%），其次是异胡薄荷醇（16.0%）和香叶醇（5.7%）。次要成分包括石竹烯（1.88%）、醋酸香叶酯（1.4%）、桉油醇（0.75%）、β-蒎烯（0.64%）、α-蒎烯（0.24%）和γ-TERPINENE（0.19%），它们可能贡献
讨论
PD 的主要特征是以黑质中多巴胺能神经元的进行性丧失，这一过程由线粒体损伤、蛋白质稳态失败、氧化损伤和代谢紊乱的汇聚驱动，当前的药理学策略无法阻止 [3]，[7]。在本研究中，我们证明 ECEO 预处理显著减轻了 N2a 神经母细胞瘤细胞中 6-OHDA 诱导的细胞毒性、氧化应激和线粒体去极化。在
CRediT 作者贡献声明
克里斯蒂娜·乌利维耶里：写作 - 审查与编辑，方法论。克劳迪娅·兰迪：写作 - 审查与编辑，验证，方法论，概念化。奥尔法·马斯穆迪 - 库基：写作 - 审查与编辑，方法论，资金获取。卢卡·比尼：写作 - 审查与编辑。乌麦玛·库基：方法论。恩希·沙巴：方法论。洛伦扎·万塔吉亚托：方法论。陶菲克·格莱里：写作 - 审查与编辑，写作 - 初稿，可视化，监督，资源，项目管理，
数据可用性
质谱蛋白质组学数据已通过 ProteomeXchange 联盟的 PRIDE 合作伙伴数据库存储，数据集标识符为 PXD073346。
资助：
这项工作得到了意大利教育、大学和研究部（MUR）在意大利国家复苏和韧性计划（NRRP）范围内的支持，托斯卡纳健康生态系统 SPOKE 7。第 1050 号部长令（2022 年 6 月 23 日）以及突尼斯高等教育和科学研究部通过授予阿梅尔·阿比迪的交流奖学金。PsyCoMed - 资助协议号：101086247，部分由阿梅尔·阿比迪资助。资助方在研究设计或实施、数据收集、分析或解释中，或在
利益冲突声明
作者阿梅尔·阿比迪、恩希·沙巴、洛伦扎·万塔吉亚托、乌麦玛·库基、奥尔法·马斯穆迪 - 库基、卢卡·比尼、克里斯蒂娜·乌利维耶里、克劳迪娅·兰迪和陶菲克·格莱里声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
阿梅尔·阿比迪 | 恩希·沙巴 | 洛伦扎·万塔吉亚托 | 乌麦玛·库基 | 奥尔法·马斯穆迪 - 库基 | 卢卡·比尼 | 克里斯蒂娜·乌利维耶里 | 克劳迪娅·兰迪 | 陶菲克·格莱里
