褪黑素口服给药通过调节Vegf信号通路调控巨噬细胞极化并改善APP/PS1小鼠的阿尔茨海默病

《Brain Research Bulletin》：Oral Administration of Melatonin Modulates Macrophage Polarization via Modulating the Vegf Signaling Pathway and Ameliorates Alzheimer’s Disease in APP/PS1 Mice

　　

口服褪黑素给药可减轻APP/PS1 AD转基因小鼠的认知障碍和海马神经元损伤。转录组分析（Transcriptome profiling）鉴定出295个海马差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），这些基因富集于神经免疫相关信号通路。褪黑素使AD小鼠海马中的小胶质细胞/巨噬细胞（microglia/macrophage）从促炎M1表型向抗炎M2表型转变。褪黑素上调Vegf（血管内皮生长因子, Vascular Endothelial Growth Factor）、Flt1（Vegf受体1）和Kdr（Vegf受体2）的表达，以激活海马组织中的Vegf信号级联反应。研究人员揭示了一个新的Vegf/巨噬细胞极化轴，该轴介导了褪黑素对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的神经保护作用。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，全球范围内是痴呆症的主要病因，其病理机制涉及β-淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）斑块沉积、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结、氧化应激、胆碱能功能障碍、线粒体损伤及神经元凋亡等。其中，神经炎症（neuroinflammation）被认为是推动AD进展的关键因素，激活的小胶质细胞和星形胶质细胞释放炎症因子，破坏神经元微环境并加剧氧化应激和神经元丢失。然而，神经炎症在AD中的精确分子机制仍不明确。褪黑素（melatonin）作为一种主要由松果体合成的神经激素，因其抗氧化、抗炎和神经保护特性，近年来被广泛研究作为AD的潜在治疗剂。已有研究表明，褪黑素可减轻AD模型中的氧化应激、线粒体功能障碍、神经元凋亡、小胶质细胞和星形胶质细胞激活，以及Aβ聚集和神经原纤维缠结形成，但其保护作用的分子机制尚未充分阐明。因此，研究人员开展本研究，旨在评估褪黑素在AD小鼠模型中的治疗效果，并利用转录组测序（transcriptome sequencing）探究其潜在机制，为AD防治提供新靶点。该论文发表在《Brain Research Bulletin》。

研究人员使用APP/PS1转基因小鼠（购自SiPeiFu Biotech Co., Ltd, 北京）作为AD模型，将10只野生型C57BL/6J小鼠（Control组）和20只APP/PS1小鼠（分为Model组和Melatonin组）进行实验。Melatonin组每日口服25 mg/kg褪黑素（溶于蒸馏水），持续4个月。主要技术方法包括：Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）测试评估空间学习和记忆能力；液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）测定血清褪黑素浓度；海马组织转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），并进行KEGG通路和GO富集分析；RT-qPCR和Western blot检测Vegf、Flt1、Kdr的mRNA和蛋白表达水平；H&E染色和Nissl染色观察海马组织病理变化；免疫荧光（immunofluorescence）检测小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物（Cd16、Cd32、Cd68、Cd206）；免疫组化（immunohistochemistry）检测Vegf、Flt1、Kdr蛋白定位。

研究结果如下：

**3.1 褪黑素改善APP/PS1小鼠的AD病理进展**
通过Morris水迷宫测试，Model组小鼠逃避潜伏期显著长于Control组，而褪黑素治疗显著缩短了该延长。Model组平台穿越次数显著减少，褪黑素组则显著增加。H&E和Nissl染色显示，Model组海马结构紊乱、神经元层不规则且稀疏，Nissl体减少；褪黑素组部分恢复海马结构，神经元密度和Nissl体显著改善。表明褪黑素可改善APP/PS1小鼠的认知障碍和海马神经元损伤。

**3.2 褪黑素调节APP/PS1小鼠海马基因表达谱**
转录组测序在Control、Model和Melatonin组海马中共获得16383个基因，主成分分析（PCA）显示Model组与Melatonin组基因表达谱相似。DESeq2分析鉴定出295个差异表达基因（DEGs），其中Melatonin组相比Model组有58个上调、237个下调。这些DEGs显著富集于1091个GO术语和30条KEGG信号通路，包括GABAergic突触信号通路。蛋白互作网络（PPI）分析识别出175个蛋白和415个相互作用，分为20个模块，涉及Isl1、Cd4、Th等关键蛋白。提示褪黑素通过调节海马基因表达影响神经免疫相关通路。

**3.3 褪黑素调节APP/PS1小鼠海马巨噬细胞极化**
免疫荧光检测显示，Model组海马中M1标志物Cd16和Cd32的平均荧光强度显著高于Control组，而褪黑素组显著降低；M2标志物Cd68和Cd206在Model组显著降低，褪黑素组显著升高。表明褪黑素使海马小胶质细胞/巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型转变。

**3.4 褪黑素调节APP/PS1小鼠海马Vegf信号通路**
血清褪黑素浓度仅在Melatonin组可检测到。RT-qPCR和Western blot结果显示，Model组海马中Vegf、Flt1、Kdr的mRNA和蛋白表达水平显著低于Control组，褪黑素组显著上调。免疫组化进一步证实褪黑素组Vegf、Flt1、Kdr阳性细胞比例升高。表明褪黑素通过上调Vegf及其受体Flt1和Kdr的表达，激活海马Vegf信号级联反应。

**讨论与结论**
讨论部分指出，AD在全球范围内给医疗系统带来沉重负担，褪黑素的治疗作用已被广泛验证，但其机制尚不完全清楚。本研究使用APP/PS1小鼠，该模型携带APP和PS1基因突变，常用于AD研究。褪黑素治疗4个月后显著改善了认知缺陷和海马损伤，与既往研究一致。尽管PCA显示Model组与Melatonin组基因表达谱相似，但鉴定出295个差异表达基因，并富集于GABAergic突触信号通路，该通路已知参与巨噬细胞极化。免疫荧光证实褪黑素促进M2极化，减少M1极化。Vegf信号通路是巨噬细胞极化的关键调节因子，在AD中与血管修复、神经保护及炎症调节相关。本研究发现褪黑素上调Vegf、Flt1和Kdr表达，提示Vegf信号通路介导了褪黑素对巨噬细胞极化的调控。研究强调，尚未能区分M1/M2样细胞是固有小胶质细胞还是浸润巨噬细胞，需进一步验证。结论部分翻译如下：总而言之，本研究结果表明，4个月的口服褪黑素给药可显著减轻APP/PS1小鼠的认知缺陷和神经元损伤。这些效应是通过褪黑素诱导的Vegf信号通路激活，进而调节海马组织中的巨噬细胞极化所介导的。本研究揭示了褪黑素治疗AD的新机制，为AD的预防和治疗提供了新见解。