《Environment International》：Mapping disease-linked AOPs to inform bioassay selection for chemical hazard assessment
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识别与非传染性疾病（noncommunicable disease, NCD）相关的体外生物测定（in-vitro assay）
15种多重测定（multiplexed assay）用于化学品和混合物的高效筛选
266条不良结果路径（Adverse O
识别与非传染性疾病（noncommunicable disease, NCD）相关的体外生物测定（in-vitro assay）
15种多重测定（multiplexed assay）用于化学品和混合物的高效筛选
266条不良结果路径（Adverse Outcome Pathway, AOP）映射到六个疾病集群
细胞毒性（cytotoxicity）、氧化应激（oxidative stress）和线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）是主要关键事件（key event）
将毒物的关键特征（key characteristics of toxicant）与AOP映射相结合确保了广泛的覆盖
**研究背景与问题**
现代社会中，超过35万种合成化学品在商业中注册，但多数未充分评估人类健康危害。当前监管毒性测试主要依赖动物实验，聚焦于顶端终点，耗时、资源密集且不符合3R原则，难以捕捉慢性低剂量效应和混合物效应。新方法方法学（New Approach Methodologies, NAM）提供更快、更机械信息化的替代方案，但缺乏系统选择终点用于危害筛查。Muncke等提出六类疾病集群（Six Clusters of Disease, SCOD）概念，涵盖与化学品暴露相关的非传染性疾病（NCDs），包括癌症、生殖障碍、代谢疾病、脑相关疾病、心血管疾病和免疫障碍。研究人员假设，通过将不良结果路径（Adverse Outcome Pathway, AOP）映射到SCOD并应用网络分析，可识别最关键的分子和细胞关键事件（Key Event, KE），作为体外生物测定优先靶点。该研究旨在利用AOP和关键特征（Key Characteristics, KC）框架，确定一组最小可行的体外细胞高通量测定，用于工业化学品危害评估。论文发表在《Environment International》。
**技术方法概括**
研究人员从AOPwiki数据库（2024年10月1日版本）提取487个AOPs，通过半自动过滤（排除结构不完整、非化学应激原、植物特异性AOPs等）后，手动评估340个AOPs与SCOD关联及人类相关性，最终266个AOPs映射到六个疾病集群。使用R语言igraph包构建每个集群的有向AOP网络，计算度中心性（Degree Centrality, DC）以识别高度连接的KEs；同时计算介数中心性和AOP简单路径出现率（AOP Simple Path Occurrence）进行敏感性分析。将每个集群排名前十的KEs与八个毒物类别的KC框架（包括致癌物、生殖毒物、内分泌干扰物等）交叉参考。最后，根据筛选标准（基于细胞系、96-384孔板兼容、暴露时间≤1周）将关键KEs映射到高通量细胞测定，最多每个终点5个候选测定，形成15种测定的示例组合。
**研究结果**
**3.1 疾病集群分配与分类覆盖**
通过质量过滤和手动评估，266个AOPs被分配到至少一个SCOD集群（94%单集群，6%双集群），占人类相关AOPs的83%。未分配的主要包括生长相关、发育效应、器官特异性毒性等。AOPs分类覆盖广泛，43%明确适用于人类，14%为啮齿类（主要映射到癌症集群），20%针对非哺乳动物但通过保守通路纳入。
**3.2 AOP疾病网络**
六个疾病集群的AOP网络规模差异显著：脑相关障碍网络最大（84个AOPs），生殖障碍（65个）、癌症（52个）、心血管疾病（28个）、免疫障碍（27个）、代谢疾病（25个）依次减小。共享KEs比例高，提示分子和细胞层面机制重叠，为开发核心体外测定组合提供依据。
**3.3 疾病网络中的关键关键事件**
排名前十的KEs中，细胞毒性（cytotoxicity）出现在全部6个集群（最高DC在脑相关：39），氧化应激（oxidative stress）出现在5个集群（最高DC在心血管：27），线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）出现在4个集群（最高DC在脑相关：16）。其他高频KEs包括炎症相关KEs（癌症、免疫、心血管集群）、AhR激活（癌症、代谢、心血管集群）、雌激素受体激活（生殖、癌症集群）。集群特异性KEs包括：癌症中细胞增殖、DNA损伤/突变/修复；生殖障碍中雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）激活、表观遗传改变；代谢疾病中甘油三酯积累、LXR激活、脂肪酸代谢；免疫障碍中上皮-间充质转化（EMT）、促炎介质分泌、NF-κB抑制；心血管疾病中eNOS解偶联、内皮网络损伤；脑相关障碍中甲状腺激素合成减少、谷氨酸增加、NMDA受体过度激活、细胞内钙超载、BDNF减少等。
**3.4 敏感性分析**
使用介数中心性和AOP简单路径出现率验证度中心性优先级，多数集群6-8个顶部KEs重叠，支持度中心性稳健性。例外：癌症集群一致性较低（3-4/10），仅细胞增殖、细胞毒性、DNA损伤/突变在所有指标中均为顶部。代谢集群中，胰岛素信号受损仅在介数指标中突出。KE合并对顶部KEs影响有限。
**3.5 关键事件与关键特征框架交叉参考**
细胞毒性、氧化应激、线粒体功能障碍在KC框架中普遍出现，为“伞形”KC。受体介导KEs与KC中受体调节特征对应。集群特异性KEs与KC框架一致度因集群而异：癌症集群基因毒性KEs与致癌物KC2-3对应；生殖障碍中表观遗传KEs与生殖毒物KC对应；代谢疾病中脂质代谢KEs覆盖部分KC，但胰腺、脂肪组织功能KEs缺失；免疫障碍中EMT、星状细胞激活无法直接关联KC；心血管疾病中发育心脏毒性KEs超出KC范围；脑相关障碍中神经递质相关KEs覆盖KC5-6，但细胞骨架、蛋白稳态相关KC未反映。
**3.6 面向适用目的的体外生物测定组合**
基于关键KEs和KC框架，研究人员提出15种细胞高通量测定示例组合，覆盖所有SCOD集群。非特异性应激反应（氧化应激、线粒体功能障碍、细胞毒性）可通过MitoOxTox等多重测定同时评估。癌症集群：微核实验（OECD TG 487）检测基因毒性，细胞增殖通过高内涵成像。生殖障碍：ER/AR报告基因测定（CALUX、GeneBLAzer等）。代谢疾病：脂质积累通过Nile Red染色（3T3-L1或肝细胞系），PPARγ激活通过报告基因。免疫障碍：NF-κB报告基因（THP1-Dual）、TNF-α分泌测定、MITI测定（IL-2/IFN-γ）。心血管疾病：AhR激活（DR CALUX）。脑相关障碍：甲状腺过氧化物酶抑制（无细胞测定）、神经突生长测定（SH-SY5Y细胞）可多重测量钙离子和AChE抑制。覆盖度评估显示癌症、生殖、代谢集群较高（KEs 64-80%，KCs 58-61%），心血管和脑相关较低（KEs 36%，KCs 40-42%）。
**3.7 局限性**
AOPwiki覆盖不均匀，代谢和心血管疾病AOPs较少，可能引入偏倚；度中心性受研究偏倚影响；AOPs质量和完整性差异；SCOD框架未涵盖发育、呼吸、器官特异性终点；关键KEs向特定测定转化存在假设和可用性限制。
**3.8 结论（翻译）**
本AOP网络分析确定了与化学品暴露相关的主要疾病集群中的关键分子和细胞KEs。通过将266个AOPs映射到SCOD并分析所得AOP网络，研究人员在三个层面识别了关键KEs：跨集群共享的非特异性终点（细胞毒性、氧化应激、线粒体功能障碍）、跨多个疾病网络出现的受体介导终点（AhR和ER信号），以及将化学品暴露与特定疾病集群联系起来的集群特异性终点。基于这些发现，研究人员将关键终点转化为测定选择，以15种细胞高通量测定示例组合展示，所有测定满足384孔板兼容、一周内读数的标准，覆盖全部六个疾病集群。将KC框架纳入选择过程，使组合扩展到AOP衍生终点之外，包括AOPwiki中尚未充分代表的生物学相关终点，并突出进一步研究需求。通过关注跨物种保守性明确的分子和细胞KEs，该组合可服务于“同一健康”化学品安全框架。该组合应被视为一个实用但尚未验证的起点，可随着新验证的高通量测定出现而系统扩展，为化学危害评估提供经验和机制基础。
