《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：ESD links tire-derived 6PPD-quinone exposure to NASH-related hepatic injury: an integrative multi-omics and in vivo study
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随着对轮胎衍生环境污染物关注度的提升，抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺（6PPD）及其氧化转化产物6PPD-醌（6PPDQ）因潜在肝毒性受到关注。尽管6PPDQ诱导肝损伤证据增加，但其与环境污染物与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的分子机
随着对轮胎衍生环境污染物关注度的提升，抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺（6PPD）及其氧化转化产物6PPD-醌（6PPDQ）因潜在肝毒性受到关注。尽管6PPDQ诱导肝损伤证据增加，但其与环境污染物与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的分子机制尚未明确。研究人员采用网络毒理学、机器学习与多组学整合框架探究6PPDQ暴露与NASH的关联。将1451个预测6PPDQ靶点与NASH相关转录组特征取交集，获得52个重叠候选介导因子，富集于氧化应激、代谢调控及ErbB、Notch、Hedgehog、Hippo、TNF等炎症信号通路。六种机器学习算法识别出五个枢纽基因EPHX2、ESD、FAS、SSB、ZNF436，单个AUC为0.711–0.825。研究人员优先分析ESD，通过功能网络分析、eQTL-GWAS共定位、免疫浸润分析、单细胞RNA测序与分子对接，将ESD定位于NASH发病核心的脂质代谢、凋亡与免疫调节回路。体内实验中，雄性BALB/c小鼠（每组n=6）腹腔注射0.4或4 mg/kg 6PPDQ共28天，出现组织学肝损伤、肝脏脂质蓄积、α-SMA阳性促纤维化活化，伴随肝脏炎症与促纤维化基因表达显著升高。血清ALT与AST剂量依赖性上升，肝脏Esd在mRNA与蛋白水平均上调。上述发现支持提出以ESD为中心的不良结局通路（AOP）框架，关联6PPDQ暴露与NASH相关肝损伤。
研究背景方面，城市化与机动车使用扩张使交通污染焦点由尾气转向非尾气源，轮胎磨损颗粒成为城市环境污染重要来源。轮胎抗氧化剂6PPD经臭氧氧化生成高活性6PPD-醌（6PPDQ），后者在雨水径流、道路粉尘及人尿、血清中广泛检出，人群内暴露明确。现有毒理研究多集中于鱼类急性死亡与多器官氧化损伤，哺乳动物研究提示6PPDQ可致小鼠剂量依赖性血清ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天冬氨酸氨基转移酶）升高、肝细胞损伤与脂质代谢扰动，但6PPDQ关联NASH的分子靶点与通路未系统阐明。NASH以肝脂肪变、小叶炎症与肝细胞损伤为核心，环境污染物经扰乱脂质稳态与免疫炎症加速其进展，但新兴轮胎源化学物在此领域的肝毒潜力几乎空白。为此，研究人员整合网络毒理学、机器学习、单细胞转录组、分子对接与体内实验，识别6PPDQ与NASH转录组交集的枢纽基因并聚焦ESD（酯酶D，S-甲酰谷胱甘肽水解酶）进行机制框架构建。
主要关键技术方法中，研究人员从GEO获取NASH转录组GSE164760与GSE89632，经SVA与ComBat批次校正后做差异表达与WGCNA（加权基因共表达网络分析）；从SwissTargetPrediction与CTD获取6PPDQ预测靶点取交集得52基因；STRING建PPI网络、Cytoscape用MCC算枢纽；六算法（GBM、XGBoost、RF、SVM、kknn、GLM）7:3分层训练测试选GBM提炼五枢纽；用eQTLGen的ESD eQTL与FinnGen R9 NASH GWAS做coloc共定位；CIBERSORT估LM22免疫浸润；Seurat分析GSE129516小鼠肝单细胞（3正常3 NASH），scTenifoldKnk虚拟敲除Esd；AutoDock Vina对接6PPDQ-ESD；体内用8周雄BALB/c（每组6只）腹腔注0.4/4 mg/kg 6PPDQ 28天做H&E、油红O、α-SMA IHC、ESD IF、qPCR与血清ALT/AST。
研究结果部分，3.1节通过整合GEO队列与WGCNA（β=26）获564个NASH候选基因。3.2节网络毒理学取1451个6PPDQ预测靶与NASH基因交得52重叠基因，PPI致密，GO/KEGG富集于氧化应激、ErbB、Notch、Hedgehog、Hippo、TNF通路。3.3节六机器学习中GBM残差最低，提炼EPHX2、ESD、FAS、SSB、ZNF436五枢纽。3.4节五基因在NASH均上调，AUC 0.711–0.825；ESD选作重点因其AUC 0.813、OR 3.348且具eQTL-GWAS共定位（PP4=0.827，rs9526236）及广功能网络。3.5节CIBERSORT显示NASH髓系（M2巨噬、单核、中性粒）浸润增、M1与γδ T减；ESD与M2巨噬/静息树突正相关、与初始B/活化肥大细胞负相关。3.6节单细胞见Esd在肝细胞最高表达，炎单核/库普弗细胞亦高；虚拟敲除下游扰Ctss、Apoc3、Apoc4、Angptl3等，富集脂质分解、脂蛋白转运。3.7节体内验证：6PPDQ致剂量依赖肝损伤、油红O阳性脂质积、α-SMA活化、Tnf/Ccl2/Col1a1/Tgfb1上调、ALT/AST升、肝Esd mRNA/蛋白上调；对接结合能?5.76 kcal/mol；提出以ESD为中心的AOP框架。
讨论部分指出，既往6PPDQ肝毒多限AhR/ROS与ERRγ脂质重编程，本研究补入Notch/Hedgehog/Hippo/TNF等跨细胞纤维化形态发生信号，52靶PPI呈多节点作用。选ESD非仅因诊断性能：其编码S-甲酰谷胱甘肽水解酶，处ADH5-ESD甲醛解毒第二步且经GSH中间体连谷胱甘肽系统，并可稳FKBP25抑mTORC1促自噬，契合NASH脂生成与自噬损；eQTL-GWAS共定位添遗传级支持。免疫上ESD关联髓系重塑而非效应群扩增。单细胞虚拟敲除汇于Ctss（巨噬基质重塑）与Apoc3（人NASH甘油三酯积相关），双轴解释脂积与纤维化。体内剂量取自既往重复暴露鼠研（4 mg/kg约为结构类似物LD50的10–20%），高于人现暴露量，属危害识别非定量风险评估。AOP框架将6PPDQ–ESD上调作为分子起始事件，下接TNF/Notch与髓系炎症，终至NASH肝伤。局限含对接非生化结合证、缺人肝组织直接关联与前瞻队列。
结论部分翻译：本研究识别ESD为6PPDQ关联靶点与NASH转录组交集的候选枢纽基因。功能网络、eQTL-GWAS共定位、免疫浸润、单细胞转录组与分子对接一致将ESD置于NASH发病核心的脂质代谢、凋亡与免疫调节回路。BALB/c小鼠体内6PPDQ暴露确认剂量依赖肝细胞损伤、脂质蓄积、促纤维化活化及并行ESD上调，为计算预测提供实验支持。整合发现支持提出以ESD为中心的AOP框架关联6PPDQ暴露与NASH相关肝损伤。确立因果ESD介导机制前，仍需生化结合 assay、ESD活性测定、功能扰动实验及整合6PPDQ暴露评估与人肝病表型的队列研究。该文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。
