拟除虫菊酯类杀虫剂与三唑类杀菌剂对蜜蜂幼虫的联合毒性

《Environmental Pollution》：Combined toxicity of pyrethroid insecticides and azole fungicides in honey bee larvae

　　

## 摘要

拟除虫菊酯类杀虫剂和三唑类杀菌剂在农业中应用频繁，蜜蜂在采集过程中通常会接触到这些农药。然而，目前大多数针对蜜蜂幼虫的研究仅关注单一化合物的暴露效应，关于混合物毒性的研究仍然有限。本研究评估了拟除虫菊酯类杀虫剂（联苯菊酯和溴氰菊酯）和三唑类杀菌剂（丙环唑和戊唑醇）的急性毒性。溴氰菊酯对蜜蜂幼虫的毒性最高，其72小时LD50为0.04 μg/幼虫，其次是联苯菊酯，LD50为0.13 μg/幼虫。相比之下，三唑类杀菌剂毒性较低，丙环唑和戊唑醇的LD50分别为49.91和21.90 μg/幼虫。除联苯菊酯与戊唑醇的混合组合外，所有二元和三元混合物均表现出协同效应。此外，农药混合物暴露改变了致死症状的分布特征。特别是早期死亡和伸展死亡成为主要致死症状，其比例在不同农药组合间存在差异。因此，联用拟除虫菊酯类杀虫剂和三唑类杀菌剂会增强对蜜蜂幼虫的毒性。

## 引言

西方蜜蜂（Apis mellifera）是农作物的重要传粉昆虫，对全球粮食生产和农业生态系统维护具有重要贡献（Hung等，2018；Potts等，2010；Thapa，2006）。除了提供传粉服务外，蜜蜂因其广泛的采集范围和较高的环境污染物敏感性，被广泛公认为环境生物指示物种（Bargańska等，2016；Fuente-Ballesteros等，2025；Porrini等，2003）。然而，过去几十年来，多个国家均报告了蜂群紊乱现象（Kulhanek等，2017；Oldroyd，2007；Potts等，2010），这被认为是严重的生态问题，可能导致作物产量下降和生态系统服务功能退化（Christmann，2019；Potts等，2010）。据报道，蜂群减少的原因包括病原体感染、栖息地丧失、气候变化和农药使用（Goulson等，2015；Potts等，2010；Vanbergen & the Insect Pollinators，2013）。蜜蜂接触农药被认为是主要因素之一（Henry等，2012；Oldroyd，2007；Ostiguy等，2019；Tomé等，2020）。蜜蜂通过摄食受污染的蜂蜜和花粉，或通过采集活动接触不同农药（Johnson，2015；Sanchez-Bayo & Goka，2014）。蜜蜂幼虫则可能通过哺育蜂提供的蜂粮接触到蜂箱内的农药残留物（Brodschneider & Crailsheim，2010；Rondeau & Raine，2022）。

拟除虫菊酯类和新烟碱类是农业害虫防治中应用最广泛的杀虫剂（Ahamad & Kumar，2023；Jeschke等，2011；Mackei等，2025）。由于部分新烟碱类杀虫剂因对蜜蜂的高风险而受到使用限制，拟除虫菊酯类杀虫剂的使用量可能随之增加（Kathage等，2018）。这意味着蜜蜂在采集过程中可能暴露于拟除虫菊酯类杀虫剂中。拟除虫菊酯类杀虫剂主要作用于神经细胞轴突上的电压门控钠通道，干扰神经元信号传导（Atchison等，2012；Johnson，2015）。拟除虫菊酯暴露可导致幼虫发育延迟和氧化应激，而成虫则出现学习和记忆能力受损、寿命缩短以及采集行为改变（Abuagla等，2024；Choi等，2024；Ingram等，2015；Wu等，2023；Zhang等，2020）。联苯菊酯（CYP）和溴氰菊酯（DTM）是应用广泛的II型拟除虫菊酯，广泛用于农作物保护，其残留物已在蜂箱基质中被检出，包括花粉和蜂粮（He等，2023；Mullin等，2010；Tong等，2018）。在北美，捕获的花粉中CYP和DTM的浓度分别为1.6–49 ppb和28–91 ppb，蜂蜡中分别为4.5–131 ppb和107–613 ppb（Mullin等，2010）。在欧洲，花粉中CYP浓度最高达214 ppb，蜂蜡中最高达9500 ppb（Raimets等，2020；Shimshoni等，2019）。在中国，花粉中DTM浓度最高达3709.8 ppb，蜂粮中最高达2906.4 ppb（Tong等，2018）。

杀菌剂通常被认为对蜜蜂无害，因为其经口和经皮LD50值较高（Edith等，2005；Iwasaki & Hogendoorn，2021；Johnson，2015）。然而，毒性试验往往忽略了亚致死效应（Desneux等，2007）。亚致死剂量的杀菌剂暴露可能对食量、免疫应答和代谢产生不利影响（Cizelj等，2016；Liao等，2017；Mao等，2017）。三唑类杀菌剂属于麦角甾醇生物合成抑制剂（EBI）类杀菌剂，在农业中广泛用于防治真菌病害。其抗真菌活性主要通过抑制细胞色素P450酶CYP51实现，该酶是真菌麦角甾醇生物合成途径中的关键催化剂（Lepesheva & Waterman，2007；Yoshida，1988）。幼虫期暴露于三唑类杀菌剂会影响蜜蜂幼虫的存活率和免疫力，并导致形态畸形等发育毒性（Kaur等，2023）。成蜂暴露于三唑类杀菌剂则会缩短寿命、改变下咽腺形态并干扰能量代谢（Drummond，2022；Kong等，2023；Mao等，2017）。丙环唑（PRO）和戊唑醇（TEB）是两种广泛使用的三唑类杀菌剂，常用于蜜蜂频繁访问的作物（如玉米、小麦和大豆），并已在蜂箱基质（包括花粉、蜂粮和蜂蜡）中被检出（Bai等，2021；Cao等，2021；Mullin等，2010；Toda等，2021）。在北美，花粉中PRO浓度为3.1–361 ppb，蜂蜡中为166–227 ppb，花粉中TEB残留物最高达34 ppb（Mullin等，2010）。在欧洲，比利时蜂场蜂蜡中PRO残留物最高达378 ppb（El Agrebi等，2020），希腊蜂场蜂粮中TEB浓度最高达150 ppb（Kasiotis等，2023）。在中国，花粉中两种农药残留物浓度最高分别为74.57 ppb PRO和93.27 ppb TEB（Wen等，2021）。

尽管已有大量研究充分评估了单一化合物对蜜蜂的毒性（Abdu-Allah & Pittendrigh，2018），但这些化合物经常在蜂箱基质中共存（Chauzat等，2011；Mullin等，2010）。根据加州农药信息门户网站的数据，在扁桃体花期，超过95%的杀虫剂与杀菌剂同时施用（Wade等，2019）。因此，蜜蜂更可能暴露于杀虫剂与杀菌剂的混合物而非单一农药中。多化合物暴露可能产生交互作用，包括对蜜蜂的协同毒性效应（Cang等，2023；Sgolastra等，2017）。多项研究报告指出，新烟碱类或拟除虫菊酯类与EBI类杀菌剂之间的交互作用对蜜蜂具有协同效应（Colin & Belzunces，1992；Iwasa等，2004；Pilling & Jepson，1993；Thompson等，2014）。这种协同效应被认为与EBI类杀菌剂在蜜蜂中抑制细胞色素P450单加氧酶有关，可能干扰解毒途径（Meled等，1998；N?rgaard & Cedergreen，2010；Pilling等，1995）。细胞色素P450酶是蜜蜂代谢植物来源化学物质和不同杀虫剂的关键酶（Berenbaum & Johnson，2015；Mao等，2011、2017），这些途径的破坏可能显著增强杀虫剂的毒性（Iwasa等，2004；Johnson等，2013）。

在蜜蜂幼虫毒性研究中，死亡率通常被用作评价农药毒性的主要终点指标（OECD，2013、2016）。然而，仅凭死亡率可能无法完全刻画蜜蜂幼虫的毒性反应模式，特别是在农药混合物暴露后。以往的幼虫毒性研究报告了与幼虫死亡相关的多种可见症状，如无法维持C形姿态、浸没在饲料中死亡、幼虫体色变暗以及异常伸展姿态（Davis等，1988；Fine等，2017；Grillone等，2017；Kim等，2021）。这些观察结果表明，致死症状可能为解读农药诱导的毒性反应提供补充表型信息。然而，基于症状的观察很少被作为补充终点指标纳入蜜蜂幼虫毒性研究，尤其是在涉及农药混合物的研究中。

本研究评估了拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯（CYP）和溴氰菊酯（DTM）以及三唑类杀菌剂丙环唑（PRO）和戊唑醇（TEB）对体外培养的蜜蜂幼虫的单一和联合毒性效应。关注这些农药组合是因为拟除虫菊酯类杀虫剂和三唑类杀菌剂已在蜂箱基质中被共同检出，表明蜜蜂存在共暴露的可能性（Mullin等，2010）。蜜蜂幼虫可通过哺育蜂提供的蜂粮接触到农药残留物（Brodschneider & Crailsheim，2010；Rondeau & Raine，2022）。幼虫期的农药暴露可导致发育延迟和存活率降低，最终影响育雏发育（Rumkee等，2015；Tomé等，2020）。然而，以往的混合物毒性研究主要关注成蜂，关于农药联合毒性对蜜蜂幼虫影响的研究仍然有限。本研究采用基于急性LD50暴露的实验室试验设计，旨在识别潜在的交互作用并为进一步评估筛选农药组合，而非直接评估与田间生态相关的风险。在环境相关的暴露水平下，毒性效应可能难以被检测，从而限制了混合物交互作用的识别。因此，LD50试验提供了一种标准化的方法，用于识别潜在交互作用，并为后续在环境相关暴露水平下的评估确定优先农药组合。据此，我们研究了各农药对幼虫死亡率、毒性交互作用、致死症状和体重的急性毒性和混合物联合效应。

## 各章节片段

### 化学品

CYP（CAS：52315-07-8；产品编号：DRE-CR11890000，纯度97.29%）、DTM（CAS：52918-63-5，产品编号：DRE-C12120000，纯度99.6%）、PRO（CAS：60207-90-1，产品编号：DRE-C16480000，纯度97.86%）和TEB（CAS：107534-96-3，产品编号：DRE-C17178700，纯度98.6%）均购自德国阿格斯堡的Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

### 幼虫培养方法

实验于2025年4月至9月进行，蜜蜂幼虫培养方法遵循OECD测试指南第237号（OECD，2013）。蜜蜂…

### 单一农药的急性毒性

在暴露于CYP、DTM、PRO和TEB后的24、48和72小时评估幼虫死亡率。阴性对照组和溶剂对照组的死亡率均低于15%。附图S1展示了各农药的剂量-反应曲线。表2总结了各农药的毒性。CYP、DTM、PRO和TEB对蜜蜂幼虫的72小时LD50值分别为0.13、0.04、49.91和21.90 μg/幼虫。在所测试的化合物中，DTM的LD50值最低，表明其…

## 讨论

本研究调查了两种拟除虫菊酯类杀虫剂和两种三唑类杀菌剂对体外培养蜜蜂幼虫的单独和联合效应。所测试的拟除虫菊酯类杀虫剂为联苯菊酯（CYP）和溴氰菊酯（DTM），三唑类杀菌剂为丙环唑（PRO）和戊唑醇（TEB）。这些农药在农作物上常用且已在蜂箱中被检出，共暴露于这些农药可降低幼虫存活率和体重。此外，死亡的幼虫中伴随增加了不同的致死症状。

## 结论

溴氰菊酯对蜜蜂幼虫的毒性最高，其次是联苯菊酯，而丙环唑和戊唑醇的毒性相对较低。除联苯菊酯与戊唑醇组合外，所有二元和三元混合物均表现出协同效应。此外，农药混合物暴露改变了蜜蜂幼虫致死症状的分布。因此，农业环境中的农药混合物可能对蜜蜂幼虫构成毒性风险，而当仅基于单一化合物进行毒性评估时，这种风险可能被低估。

## CRediT作者贡献声明

Ji-Hoon Lee：写作——审阅与编辑，验证。

Kyongmi Chon：写作——审阅与编辑，验证，监督，项目管理，方法论，经费获取，概念化。

Minju Choi：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理，概念化。

Hui-Yeon Ahn：调查研究。

Juyeong Kim：方法论，调查研究。

Bala Murali Krishna Vasamsetti：调查研究。

Bo-Seon Kim：…

## 未引用参考文献

Vanbergen and the Insect Pollinators，2013.

## 利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

## 数据可用性

数据可根据要求提供。

## 生成式AI及AI辅助技术在手稿准备过程中的使用声明

在本手稿的准备过程中，作者使用了ChatGPT来检查语法并提高手稿的可读性。

使用本工具/服务后，作者对内容进行了审阅和编辑，对已发表文章的內容承担全部责任。资金支持：本研究得到韩国农村发展管理局国立农业科学研究院农业科学技术发展研究项目（项目编号：PJ01579701）的资助，同时部分由韩国农村发展管理局与大学2025年联合研究项目支持。利益冲突声明 ? 作者声明，不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。致谢：作者感谢养蜂部门的蜂农提供的帮助。崔敏珠|秦景美|金玉英|安惠妍|金甫善|Bala Murali Krishna Vasamsetti|尹昌永|黄韶正|朴京勋|李在勋 韩国农村发展管理局国立农业科学研究院农业食品安全与作物保护部毒性与风险评估科，全罗北道完州郡伊沼面，55365，大韩民国