工程化尿苷二磷酸半乳糖基转移酶 PhUGT 实现由槲皮素高效全细胞生物合成异槲皮苷

《Food Bioscience》：Engineering a Uridine Diphosphate Galactosyltransferase PhUGT Enables Efficient Whole-Cell Biosynthesis of Hyperoside from Quercetin

　　

摘要

金丝桃苷（槲皮素 3-O-半乳糖苷）是一种具有前景的生物活性黄酮糖苷，在制药和食品工业中具有潜在应用。然而，其实用化受到天然丰度低限制植物提取效率以及化学合成固有的区域选择性差等问题的制约。在此，我们通过工程化矮牵牛（Petunia hybrida）的尿苷二磷酸（UDP）半乳糖基转移酶PhUGT 并优化其在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达，构建了一个用于生产金丝桃苷的高效全细胞生物催化系统。经过结构导向工程改造，所得突变体PhUGT-S140A/H144G/F194A 对槲皮素的活性提高了 2.2 倍。进一步筛选 N 端融合标签和启动子提高了PhUGT 的表达，从而使全细胞生产率分别提高了约 1.5 倍和 1.6 倍。结合大肠杆菌尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶（GalE）和拟南芥蔗糖合成酶（AtSuSy）辅助的尿苷二磷酸半乳糖再生，优化后的全细胞系统在 12 小时内生产了 2.4 g·L^-1金丝桃苷，得率为 86.17%，生产率为 197.1 mg·L^-1·h^-1。据我们所知，这代表了迄今为止报道的全细胞金丝桃苷生产最高生产率。因此，本研究为改善基于 UDP 依赖糖基转移酶的金丝桃苷及相关黄酮糖苷的全细胞生物合成提供了一条可行途径。

引言

黄酮糖苷是植物天然产物的主要类别，在药物、营养保健品和功能性食品中具有广泛应用（Hu et al., 2023; Li et al., 2019）。其中，金丝桃苷作为一种黄酮糖苷（槲皮素 3-O-半乳糖苷），因其多样的生物活性而备受关注，包括抗氧化（Shan et al., 2026）、抗病毒、抗炎（Kim et al., 2011）和心脏保护作用（Cheng et al., 2024）。近年来，随着其市场需求的增长（Hua et al., 2023），金丝桃苷被广泛用于药物、保健产品、化妆品和食品添加剂中（Wang et al., 2023）。这些有益特性使金丝桃苷成为一种具有显著市场份额的高价值生物活性化合物。

目前，金丝桃苷主要通过从植物来源中提取获得，例如黄蜀葵（Abelmoschus manihot，A. manihot）和贯叶连翘（Hypericum perforatum）的花，以及山楂（Crataegus pinnatifida）的叶。其中，A. Manihot花含量最高，但也仅达到 1.12%（Qiu & Wang, 2013）。然而，这种传统途径通常受限于目标化合物在原生宿主中的低丰度、植物资源的变异、繁琐的下游纯化以及可扩展性有限（Zhang et al., 2024）。化学合成提供了一种替代方法（Duan et al., 2024），但由于槲皮素具有多个羟基基团且需要繁琐的保护 - 去保护步骤，其选择性半乳糖基化仍然困难（Cao et al., 2011）。因此，开发高效且可持续的生产路线已成为关键的研究重点（Hussain et al., 2012）。

酶法合成具有几个引人注目的优势，包括高区域选择性、温和的反应条件和改善的可持续性。特别是，尿苷二磷酸（UDP）依赖的糖基转移酶（UGTs）已被证明是通过将活化的糖供体转移到黄酮受体的特定羟基基团上来合成黄酮糖苷的有前景的生物催化剂。先前的研究表明，基于糖基转移酶的生物催化可以规避化学糖基化的许多局限性，并且可以有效地与核苷酸糖再生系统或微生物代谢工程相结合，以拓宽产品多样性并提高过程经济性（Li et al., 2022; Zu-Man et al., 2024）。例如，蔗糖合成酶偶联糖基化系统被用于以经济的方式生产黄酮葡萄糖苷（Son et al., 2009），而工程化大肠杆菌（E. coli）菌株通过途径工程和顺序糖基化实现了多种槲皮素糖苷和二糖苷的生物合成（De Bruyn et al., 2015; Gu et al., 2020），共同证明了酶法和微生物路线生产该化合物的可行性。

基于这些进展，全细胞生物催化提供了一种将糖基化与细胞内糖供体再生相结合的实际方法。Gu et al. (2020) 证明，循环使用静息细胞在 72 小时内将平均金丝桃苷生产率提高到 126 mg·L^-1·h^-1，并在 168 小时内的七个循环周期后，累积金丝桃苷产量相当于 18.0 g·L^-1。De Bruyn et al. (2015) 开发了一个利用蔗糖的E. coli平台用于细胞内 UDP-糖的形成，从槲皮素生产了 0.94 g·L^-1金丝桃苷。随后，Li et al. (2022) 共表达了矮牵牛（P. hybrida）UDP-半乳糖基转移酶（PhUGT）、E. coli UDP-葡萄糖 4-差向异构酶（GalE）和大豆蔗糖合成酶，以及分子伴侣 GroEL/ES 以改善PhUGT 的溶性表达。所得全细胞系统生产了 863.7 mg·L^-1金丝桃苷，转化率为 93.6%，生产率为 72.5 mg·L^-1·h^-1。综上所述，这些研究表明，改善细胞内糖供体供应、酶表达和生物转化策略可以显著提高全细胞金丝桃苷生产。然而，直接对PhUGT 进行工程化以提高其催化性能在全细胞金丝桃苷生物合成中 largely 未被探索。因此，PhUGT 催化性能、异源表达和细胞内尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）供应的协调优化是否能进一步提高全细胞金丝桃苷生产仍然未被充分探索。

在本研究中，我们通过解决P. hybrida UDP-半乳糖基转移酶（UDP-Gal）PhUGT 在E. coli 中催化活性低和异源表达弱的问题，建立了一个有效的从槲皮素生产金丝桃苷的全细胞生物催化系统（图 1）。通过靶向工程改造，我们获得了一种对槲皮素表现出高 2.2 倍催化活性的PhUGT 突变体。同时，通过筛选 N 端融合标签和启动子，增强了PhUGT 在E. coli中的异源表达。为了减少对体外供应糖供体的依赖，我们将E. coli UDP-葡萄糖 4-差向异构酶 GalE 和拟南芥（A. thaliana）蔗糖合成酶AtSuSy 整合到全细胞系统中，建立了一个偶联的糖供体再生模块。通过这些综合改进，工程化系统在补料分批发酵过程中达到了 2.4 g·L^-1的金丝桃苷浓度，并表现出 86.17% 的得率。除了为金丝桃苷生产提供有效方法外，这项工作还为工程化基于 UGT 的全细胞平台以生产相关黄酮糖苷建立了一个通用框架。

章节摘要

菌株和质粒

本工作中使用的质粒、菌株和基因详见表 S1–S3。来自P. hybrida的糖基转移酶PhUGT（登录号：AF165148.1）为了在E. coli中表达进行了密码子优化，并由翌圣生物科技（无锡）有限公司商业合成（Chen et al., 2019）。galE基因通过聚合酶链式反应（PCR）从E. coli MG1655 染色体 DNA 基因组中获取（表 S4）。来自A. thaliana的AtSuSy 基因（登录号：NM_001036838.2）（Yang, Yang,

蛋白质工程优化PhUGT 的催化活性

虽然PhUGT 能够催化槲皮素的半乳糖基化以生产金丝桃苷（Bertoli et al., 2010），但其催化活性对于高效生物合成仍然不理想（图 2a, 2b）。为了改善其催化性能，采用了一种基于半理性工程的策略。首先，使用 AlphaFold3 预测PhUGT 的结构，并将槲皮素与糖供体 UDP-Gal 对接到酶中以生成推定的PhUGT-槲皮素-UDP-Gal 三元

结论

在本研究中，我们通过整合蛋白质工程、表达优化和糖供体再生，建立了一个从槲皮素生产金丝桃苷的高效全细胞生物催化平台。PhUGT 的半理性工程产生了突变体PhUGT*（S140A/H144G/F194A），其对槲皮素的催化活性提高了 2.2 倍。虽然PhUGT* 的k_cat从 0.024 降至 0.010 min^?1，但其对槲皮素的表观K_m从 437.8 降至 89.9 μM，

CRediT 作者贡献声明

Yijian Rao: 写作 - 审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。Lu Cai: 方法论。Yu Geng: 方法论。Yue Gao: 写作 - 审阅与编辑，概念化。Shan Lin: 方法论。Zhiwei Deng: 软件，方法论。Mengjiao Li: 写作 - 初稿，方法论，调查

未引用参考文献

Yang 等人，2024 年。

竞争利益声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

数据可用性

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竞争利益声明

? 作者声明，他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了 国家自然科学基金（32270082 和 32501318）和 中央高校基本科研业务费（JUSRP202404012）的支持。

Mengjiao Li|Zhiwei Deng|Yu Geng|Lu Cai|Shan Lin|Yue Gao|Yijian Rao

江南大学生物工程学院，教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国 无锡 214122