食品加工设施中单核细胞增生李斯特氏菌持久性的分子与环境指标：一种多领域方法

《Food Microbiology》：Molecular and environmental indicators of Listeria monocytogenes persistence in food processing facilities: a multi sector approach

　　

摘要：单增李斯特菌是一种食源性病原体，能够在食品加工环境中持续存在。这种持续性源于菌株特异性性状与环境条件之间的相互作用。本研究旨在识别与高风险食品生产领域中单增李斯特菌持久性相关的分子和环境指标。在海产品、蔬菜和猪肉（各 3 家）行业的九家设施中进行了三次环境采样活动。共分析了 1,097 个样品，检测其是否含有单增李斯特菌、温度、表面特性、pH 值、湿度和表面特性。在 114 个样品中（≈10%）检测到单增李斯特菌，其中蔬菜行业的检出率最高。通过全基因组测序对分离株进行特征鉴定，并根据核心基因组多位点序列分型（cgMLST）谱系将其分类为持续性或暂时性聚类。持续性聚类的定义为等位基因差异≤7，且在至少两次采样活动中重复检出，而暂时性分离株仅检测一次。我们确定了 13 个持续性聚类，包括 67 个分离株，其中 42 个被分配给 CC121，9 个给 CC5，5 个给 CC31，4 个给 CC101，4 个给 CC155，3 个给 CC412。泛基因组分析在持续性分离株中识别出几个富集的基因座，包括前噬菌体相关基因座、编码转运系统（如 TatA、TatC 和 EfeO）的基因，以及参与应激反应机制的基因。持久性与较高的总微生物计数和高湿度相关，持续性分离株主要在总微生物计数超过 5–6 log CFU/mL 且相对湿度超过 80% 的条件下被检测到。总体而言，结果强调了细菌遗传性状与环境条件之间的相互作用导致了持久性，突出了在食品加工环境中进行监测和控制的综合方法的重要性。

引言 单增李斯特菌是一种革兰氏阳性兼性胞内细菌，在环境中无处不在，被公认为最具毒力的食源性病原体之一。它是李斯特菌病的病原体，这是一种主要影响老年人、孕妇、新生儿和免疫功能低下患者的侵袭性疾病（Koopmans 等，2022）。在欧洲，2024 年李斯特菌病的发病率约为每 100,000 名居民 0.69 例。在美国，2008 年至 2016 年间，发病率较低，约为每 100,000 名居民 0.28 例（不包括孕妇）。尽管发病率相对较低，但李斯特菌病与高住院率（>90%）和 14.2% 至 18.2% 的病例死亡率相关（Pohl 等 2019；EFSA 和 ECDC，2025）。全球已报道多起李斯特菌病爆发事件，通常与即食产品的消费有关，凸显了单增李斯特菌在食品加工环境中生存的能力。单增李斯特菌能够在同一食品生产环境中生存数月甚至数年，这种现象称为持久性。在食品加工环境中，单增李斯特菌分离株通常被分类为暂时性或持续性。暂时性菌株是零星检测到的，而持续性菌株是随时间从同一环境中重复分离出来的。因此，持久性可以广泛定义为菌株在特定生态位中在较长时间内生存并保持可检测到的能力。然而，持久性尚未以完全标准化的方式定义。在实践中，研究通常依赖两个主要标准：分离株之间的遗传相关性及其随时间的重复恢复。遗传相关性通常使用阈值进行评估，如≤7 个核心基因组多位点序列分型（cgMLST）等位基因差异或≤20–25 个单核苷酸多态性（SNPs）。然而，定义持久性所需的时间间隔在不同研究之间仍然是可变的，从几个月到几年不等（Fagerlund 等，2022；Jagadeesan 等，2019；Unrath 等，2021）。

在一些爆发事件中，回顾性调查显示爆发菌株与先前从加工环境中恢复的分离株在遗传上相关，表明持续性菌株的参与。2008–2009 年加拿大的爆发与此相关，该爆发与即食肉类有关，事后在同一加工设施中检测到相同的克隆，且已循环超过 22 年（Currie 等，2015；Knabel 等，2012）。类似地，美国与冰淇淋相关的多州爆发揭示了 2010 年至 2015 年间同一生产设施内遗传相同的单增李斯特菌分离株的持续性（Conrad 等，2023）。

单增李斯特菌的持久性源于菌株特异性分子特征和环境条件的复杂组合。多项研究表明，某些克隆复合体（CC）经常与持续性污染相关，表明特定的遗传性状可能有助于长期生存。在食品加工环境中单增李斯特菌的持续性事件中报告了多个 CC，尽管某些 CC，如 CC1、CC2、CC4、CC6、CC9、CC31、CC87、CC121 和 CC321，根据行业、采样策略和研究设计被反复鉴定（Alteio 等，2025；Fagerlund 等，2022；Hazards (BIOHAZ) 等，2024；Poutou-Pi?ales 等，2026）。为了更好地了解这些持续性菌株的复发，进行了更详细的分析。例如，在 Palaiodimou 等（2021）的研究中，对从肉类加工环境中分离的六种暂时性菌株和七种持续性李斯特菌属菌株之间的基因含量进行了比较分析。使用 BLAST 分析，作者识别出几个与持续性相关的遗传因素。其中，编码小多重耐药性（SMR）家族外排泵的 qacH 基因，涉及对食品工业中常用作消毒剂的季铵盐化合物的耐受性，仅在持续性菌株中特异性检测到。此外，该研究的所有持续性菌株都携带导致 inlA 基因出现过早终止密码子（PMSC）的点突变，该基因编码参与宿主细胞入侵的表面蛋白内部蛋白 A。这些突变导致缺乏 LPXTG 序列基序的截短蛋白。Maggio 等（2021）也报道了此类 inlA 突变与持续性之间的关联。在他们的研究中，调查了来自熏制三文鱼加工厂的 19 株单增李斯特菌分离株，作者评估了生物膜形成和分子特征对持续性的综合影响，并观察到某些持续性菌株，特别是在 CC19 内，也携带毒力基因 inlL。总体而言，这些发现突出了特定遗传决定因素与单增李斯特菌持续性之间的关联，特别是参与应激反应机制的基因，如对消毒剂（qacH）的抗性，以及像 inlA 和 inlL 这样改变毒力相关基因，这可能也与生物膜形成有关（Franciosa 等，2009；Popowska 等，2017）。这些分子性状可能通过提高应激耐受性、表面定植或在不利条件下的生存提供适应性优势。然而，它们的存在本身并不能完全解释为什么某些菌株随时间在食品加工环境中建立，而其他菌株保持暂时性。持久性可能仅在这些菌株特异性性状与有利的环境条件（如合适的表面、有机残留物、湿度、微生物群落或清洁和消毒难以触及的区域）相互作用时发生。因此，持久性应被视为一种多因素性状，源于遗传决定因素与环境条件之间的复杂相互作用，这可能有助于细菌适应（Daeschel 等，2022）。

在这种背景下，食品加工设施内的环境条件在细菌生存和定植中起着关键作用。设备设计、表面材料和难以清洁区域的存在等结构特征可以促进持续性种群的确立（Carpentier 和 Cerf 2011；Ferreira 等 2014）。例如，Kyere 等（2020）比较了在存在有机物的情况下，单增李斯特菌在 10°C 下 48 小时生物膜形成过程中的活性和可培养种群。他们证明，在存在沙拉滤液的情况下，单增李斯特菌的生物膜种群增加了至少 3 log CFU/cm2。此外，操作实践，特别是清洁和消毒程序以及生产流程，施加选择压力，可以促进细菌对工业环境的适应（Tuytschaever 等，2023）。这些因素根据加工设施内的环境生态位而有很大差异。通过分析 32 项研究，Belias 等（2022）强调了“生存生态位”的存在，定义为工业环境中促进单增李斯特菌持续性的特定区域。然而，这些生态位的性质和分布在生产地点之间存在差异，强调了在研究持久性机制时考虑特定行业背景的重要性。

迄今为止，以前的研究大多集中在单增李斯特菌菌株的分子表征或环境风险因素上，通常是在单一生产行业内。这种碎片化的方法限制了对持久性机制的全面理解，并阻碍了在食品工业中识别稳健和可泛化的指标。因此，分子和环境因素对不同生产行业中单增李斯特菌持久性的共同贡献仍然记录不足（Alteio 等，2025）。在这种情况下，一种结合菌株水平分子数据与来自多条生产链的详细环境信息的多行业方法似乎对于更好地表征持久性谱并识别稳健的跨领域指标至关重要。因此，本研究的目的是识别和表征与食品工业不同高风险行业中单增李斯特菌持久性相关的分子和环境指标。通过结合分离株的分子分型和基因组分析与从多个加工设施收集的环境数据，寻求了持续污染事件中涉及的关键因素。

部分摘录 采样活动和环境测量 在 2023 年 6 月 7 日至 2024 年 2 月 28 日期间，在法国三个行业（海产品（设施 A、B 和 C）、蔬菜（设施 D、E 和 F）和猪肉（设施 G、H 和 I））的九家食品加工设施中，进行了三次连续的采样活动，间隔三个月。在每个设施中，采样点是与相应加工厂的质量经理合作选择的，重点是关键控制点和被认为是

遗传多样性和持续性单增李斯特菌克隆的鉴定 总体而言，114 个表面样品呈单增李斯特菌阳性，对应的总体发生率为 10.40%（表 1）。这种发生率在所研究的行业中有所不同。蔬菜行业的污染率最高，平均发生率为 14.29%（所有设施合计），而猪肉和海产品行业的发生率较低，分别为 9.72% 和 7.37%。采样活动之间也观察到变异性。第一次采样活动显示最高

讨论 本研究的目的是识别与食品工业不同行业中单增李斯特菌持久性相关的分子和环境指标。通过结合 WGS、cgMLST 分型和详细的环境表征，我们的结果强调了单增李斯特菌的持久性依赖于遗传决定因素和有利环境条件的组合，而不是单一因素。

结论 总之，本研究通过结合微生物学、基因组和环境分析的多行业方法，提供了食品加工环境中单增李斯特菌持久性的综合视角。在三个高风险食品生产行业中进行的三次采样活动揭示了 10.40% 的总体环境发生率，确认了该病原体在调查设施中的规律性存在。遗传多样性分析突出了

CRediT 作者贡献声明 Benjamin Duqué；：写作 – 审查与编辑，方法学，调查。Erwan Bourdonnais：写作 – 审查与编辑，方法学，调查。Mélanie Gay：写作 – 审查与编辑。Guylaine Leleu：写作 – 审查与编辑，调查。Maylis Bellay：写作 – 原稿，可视化，验证，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。Christophe Soumet：写作 – 审查与编辑，验证，方法学，调查，资助

未引用参考文献 EFSA, 2025; Hazards et al., 2024.

利益冲突声明 作者声明没有利益冲突

资助 这项工作由法国国家研究署（ANR）根据合作研究项目（PRC）SUBLIM（ANR-22-CE21-0010）资助。

利益冲突声明 ? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢 我们感谢所有参与数据生成和手稿准备的合作伙伴。我们要感谢位于 Ploufragan 的 ANSES 实验室提供测序服务。我们还要感谢海洋捕捞和水产品加工工业协会（CITPPM）对本工作的贡献。

Maylis Bellay|Virginie Chesnais|Bastien Fremaux|Carole Feurer|Pauline Champigny|Aurélie Hanin|Erwan Bourdonnais|Benjamin Duqué|Guylaine Leleu|Mélanie Gay|Christophe Soumet|Dominique Hurtaud-Pessel|Kahina Slimani|Meryl Vila Nova|Arnaud Bridier|Thomas Brauge

ANSES，食品安全实验室，SANAQUA 单位，法国布洛涅 - 于尔河 62200