《Future Foods》：Elucidation of peptidomics,
in vitro gastrointestinal digestion, and the mechanism of bioactive peptide formation in plant-based cheese alternative produced from EU PDO Malatya apricot (
Prunus armeniaca L.) kernel protein and fermented with water kefir
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本研究首次全面探讨了蛋白水解及后续体外胃肠道系统消化对植物基奶酪替代品（PCAs）中生物活性肽动态变化的影响。欧盟PDO马拉蒂亚杏（*Prunus armeniaca* L.）仁（无苦味且不含氰苷）被用作PCA生产中的蛋白质来源，并采用水开菲尔发酵产品。SDS
本研究首次全面探讨了蛋白水解及后续体外胃肠道系统消化对植物基奶酪替代品（PCAs）中生物活性肽动态变化的影响。欧盟PDO马拉蒂亚杏（*Prunus armeniaca* L.）仁（无苦味且不含氰苷）被用作PCA生产中的蛋白质来源，并采用水开菲尔发酵产品。SDS-PAGE和RP-HPLC肽分级结果显示，大分子肽被成功消化，小分子肽数量增加。此外，发酵促进了PCAs中生物活性肽数量的增加，在对照组和发酵样品中分别鉴定出71种和95种。一致地，消化后ACE抑制（ACE-i）活性和抗氧化活性也显著增加。在未消化和消化的PCAs中，ACE-i活性从43.98-45.49%增加到90.79-92.76%，DPPH抗氧化能力从417.24-445.96 mg TEAC/kg增加到774.14-806.68 mg TEAC/kg，CUPRAC抗氧化能力从0.76-1.05 mMol Trolox/g增加到2.79-3.10 mMol Trolox/g。总之，研究发现杏仁蛋白的消化能力相当高，在PCA生产中使用水开菲尔提高了杏仁蛋白的消化率并增加了生物活性肽的数量。
**论文解读**
**1. 研究背景与问题**
随着全球人口增长和资源压力，从动物蛋白向植物蛋白的饮食转变已成为必然趋势，预计到2050年植物蛋白消费比例需从40%提升至60%。植物基奶酪替代品（PCAs）在这一转变中扮演重要角色，但其在风味、质构和营养特性上仍需改进。目前，PCAs的研究多集中于感官特性，其营养评估，特别是在肽组学水平上的详细蛋白水解模式，存在显著的研究空白。虽然植物蛋白被认为是生物活性肽的潜在来源，但由于缺乏在真实食品基质中肽形成的序列水平鉴定和理解，这一潜力在很大程度上仍停留在假设阶段。因此，评估PCAs中蛋白质的消化性和健康效益至关重要。本研究旨在探讨使用水开菲尔发酵的PCAs在储存期间的蛋白水解变化，以及模拟体外胃肠道消化（GID）后的生物活性特性，以揭示杏仁蛋白作为蛋白质来源尚未被评估的特性，并填补PCAs领域的空白。该论文发表在《Future Foods》期刊。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过SDS-PAGE和RP-HPLC对肽的分子量分布和谱图进行表征。其次，利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF/MS）结合MaxQuant软件进行肽段的鉴定，并以UniProtKB数据库中的杏（*Prunus armeniaca*）仁蛋白作为参考数据集。接着，使用CAMP
3RF、mAHTPred和AnOxPP等在线工具对鉴定出的肽段进行抗菌、血管紧张素转换酶抑制（ACE-i）和抗氧化活性的计算机（*in silico*）预测。最后，通过体外化学方法（DPPH和CUPRAC法）测定抗氧化能力，并通过HPLC方法测定ACE-i活性。样本来源为欧盟PDO马拉蒂亚杏仁蛋白制成的PCAs，分为未发酵对照组（C-PCA）和水开菲尔发酵组（W-PCA），并在储存第1天和第60天进行分析。
**3. 研究结果**
**3.1 SDS-PAGE图谱**
SDS-PAGE图谱显示，未消化样品在18至57 kDa范围内存在多个多肽条带，发酵和储存时间未引起条带位置的显著差异，但水开菲尔发酵使18、28、31和35 kDa处的条带强度减弱，表明水开菲尔中微生物的蛋白水解活性降低了多肽含量。体外GID消化后，所有10 kDa以上的条带消失，仅剩余低于10 kDa的肽段，表明杏仁蛋白被消化酶有效分解为低分子量肽。
**3.2 RP-HPLC肽谱**
RP-HPLC肽谱分析进一步证实了SDS-PAGE的结果。在消化后的样品中，观察到12至65分钟之间出现了大量新的肽峰，表明大分子肽被裂解为短链肽段。在未消化样品中，水开菲尔发酵组（W-PCA）在早期保留时间（10-25分钟）和晚期保留时间（35-55分钟）的峰面积与对照组（C-PCA）存在显著差异，且W-PCA样品中高分子量肽对应的峰面积（如81、82、84分钟）显著减少，证明了发酵促进了蛋白水解。
**3.3 肽组学**
通过LC-QTOF/MS鉴定，在未发酵的C-PCA样品中，肽段数量从第1天的3个增加到第60天的86个，而发酵的W-PCA样品中，肽段数量从第1天的56个增加到第60天的78个，表明发酵加速了早期蛋白水解。消化后，所有样品中的肽段数量均大幅增加（如W-PCA d60消化后达390个肽段），且超过一半的肽段为短链肽。肽段主要来源于11S种子贮藏蛋白/球蛋白（65.79-70.92%），其次是NO VEIN蛋白C端结构域蛋白（13.73-16.82%）。计算机预测表明，消化后具有ACE抑制、抗氧化和抗菌潜力的肽段数量显著增加，尤其是在发酵样品中。例如，在发酵PCAs中，消化后ACE抑制肽从20个增加到71个，抗氧化肽也显著增加。
**3.4 ACE-i活性**
ACE-i活性测定结果表明，消化处理显著（P<0.001）提高了所有PCAs样品的ACE-i活性。在未消化时，ACE-i活性范围为43.98%至53.36%，而消化后，该活性显著提升至90.79%至92.76%。值得注意的是，虽然在未消化状态下，发酵样品（W-PCA）的ACE-i活性低于对照组（C-PCA），但消化后两者均达到相当高的水平，且发酵样品在60天储存后消化，活性最高（92.76%）。这一结果与肽组学分析中消化后ACE抑制肽数量增加的现象一致，表明消化促进了具有降血压潜力的肽段释放。
**3.5 抗氧化特性**
通过DPPH和CUPRAC两种方法测定的抗氧化活性结果趋势一致，均显示消化后样品的抗氧化能力显著（P<0.001）高于未消化样品。例如，DPPH值从未消化时的417-446 mg TEAC/kg增加到消化后的760-807 mg TEAC/kg。此外，样品、储存时间和消化之间还存在显著的交互效应（P<0.001），表明发酵、储存和消化共同影响PCAs的抗氧化能力。在未消化样品中观察到的抗氧化活性可能源于杏仁中固有的酚类化合物、生育酚等抗氧化成分。
**4. 总结与结论**
研究人员首次全面阐明，储存期间的蛋白水解及后续的体外胃肠道消化显著影响了PCAs中的肽动态和生物活性肽的形成。研究结论指出，杏仁蛋白的消化能力很高，无论是内源性的杏仁蛋白酶还是水开菲尔中的蛋白水解微生物，均对肽的多样性有贡献；消化过程显著增加了肽段，尤其是短链三肽的数量，并大幅提升了ACE抑制活性和抗氧化能力。发酵过程进一步增加了生物活性肽的数量：在对照组（C-PCA）样品中鉴定出71种具有抗氧化和ACE-i活性的肽，而在发酵组（W-PCA）样品中则鉴定出95种。因此，基于杏仁的PCAs不仅是一种替代蛋白源，通过优化发酵和储存条件，其还有潜力成为一种具有积极健康效益的生物功能性食品。但研究也指出，由于使用杏仁压榨饼可能使终产品总蛋白含量较低，导致摄入的生物活性肽数量较少，未来研究建议使用杏仁蛋白分离物以提高单位产品中的生物活性肽数量。
