粪便中低水平噬菌体残留与微生物群落及耐药性相关谱的变化相关

《Environment International》：Low-level phage residues in manure are associated with shifts in microbial communities and resistance-related profiles

　　

噬菌体作为抗生素替代品在畜牧生产系统中的探索日益增多。然而，噬菌体施用后通过粪便排泄出的残余噬菌体的生态影响仍知之甚少。为此，研究人员建立了一个为期42天的粪便微宇宙系统，以评估含有经口施用噬菌体混合物的鸡的粪便中残余噬菌体的粪便输入相关的生态响应。尽管排泄的噬菌体比例相对较低（低于施用剂量的1%；4.28 ± 0.027 log₁₀ PFU·天^?1），但它与细菌多样性降低和共现网络复杂度下降相关。这些变化伴随着抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）和移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs）相对丰度的增加。值得注意的是，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）的相对富集与耐药性相关性状密切相关，表明特定细菌类群的改变可能促进ARGs和MGEs的动态变化。总体而言，研究人员的发现表明，含有残余噬菌体的粪便输入可能具有先前未被充分认识的生态影响，特别是在微生物群落重塑和耐药性相关基因动态方面。这些发现强调了在“One Health”框架下持续研究噬菌体应用环境维度的重要性，以促进其负责任的发展。

**研究背景与问题**
抗菌素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）是严峻的公共卫生挑战，预计未来25年内将直接导致3900万例死亡及1.69亿例相关死亡。多药耐药（multidrug-resistant, MDR）细菌的全球威胁促使噬菌体被越来越多地探索作为抗生素替代品。然而，在噬菌体治疗中，施用的噬菌体可能部分通过宿主胃肠道存活并随粪便排出。排泄的噬菌体剂量依赖性存在，残余噬菌体可能通过捕食驱动的群落变化和级联生态效应破坏局部微生物生态位或改变基因转移潜力。目前，粪便中残余噬菌体对微生物群落及抗性基因动态的影响尚不明确，因此开展本研究以评估其生态安全。

**研究内容与结论**
研究人员建立了一个42天的粪便微宇宙系统，采用来自经口施用噬菌体混合物（靶向MDR大肠杆菌）或无菌水的鸡的粪便悬浮液，模拟含有残余噬菌体的粪便输入对非灭菌及灭菌粪便基质的影响。通过16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组测序、病毒组分析及结构方程模型（structural equation modeling, SEM），发现含有残余噬菌体的粪便输入与细菌群落多样性降低、共现网络复杂度下降、抗生素抗性基因（ARGs）和移动遗传元件（MGEs）相对丰度增加相关。特定细菌属如Psychrobacter的富集与抗性基因动态紧密关联，表明噬菌体残留可能通过影响细菌类群间接促进ARGs和MGEs的扩散。该研究发表于《Environment International》，强调了在One Health框架下评估噬菌体应用环境风险的重要性。

**主要技术方法**
1. 噬菌体混合物制备：采用PEG 8000沉淀法纯化两种裂解性噬菌体（VB_Ecos_Lzu_P1和VB_Ecos_Lzu_P3），混合后稀释至1.0×10⁹ PFU·mL^?1。
2. 动物饲养与粪便悬浮液制备：24只公鸡随机分为两组，分别经口给予噬菌体混合物或无菌水，收集粪便制备悬浮液（1:10 w/v，SM缓冲液，过滤除杂质）。
3. 粪便移植微宇宙实验：设置三种处理——非灭菌基质+对照粪便悬浮液（CON）、非灭菌基质+含噬菌体粪便悬浮液（NMP）、灭菌基质+含噬菌体粪便悬浮液（IMP），每日喷洒，持续42天，于第0、3、7、14、42天破坏性采样。
4. 理化性质测量：测定有机质（OM）、铵态氮（NH₄⁺-N）、硝态氮（NO₃^?-N）、总氮（TN）、总磷（TP）、总钾（TK）、pH、电导率（EC）。
5. 16S rRNA基因扩增子测序：V3-V4区扩增，Illumina NovaSeq 6000测序，DADA2去噪，基于ASV分析群落结构。
6. 宏基因组测序：Illumina NovaSeq测序，DIAMOND+BLASTx比对SARG数据库和MobileOG-db定量ARGs和MGEs，contig组装分析共定位。
7. 病毒宏基因组分析：VirSorter2、VIBRANT、GeNomad鉴定病毒序列，CheckV质控，热图及iPHoP预测宿主。
8. 统计分析：ANOVA、SEM，共现网络使用Gephi可视化。样本来源：兰州大学动物实验。

**研究结果**
**3.1 NMP处理改变细菌群落结构与多样性**
通过16S rRNA基因扩增子测序发现，NMP处理（非灭菌基质+含噬菌体粪便悬浮液）显著改变细菌群落组成（NMDS分析，stress=0.037），降低Chao1、观测物种数及Faith’s PD指数，减少放线菌门和拟杆菌门相对丰度，增加变形菌门相对丰度；属水平上Psychrobacter和Jeotgalicoccus相对丰度升高。共现网络复杂度降低（节点和边数减少）。

**3.2 受体微生物群落中ARGs和MGEs的谱系与动态**
宏基因组数据显示，NMP组ARGs总丰度（每16S rRNA基因拷贝数）显著高于CON组（P<0.05），共检测到26个ARG类型和557个亚型；MGEs总丰度也显著升高（P<0.05），噬菌体相关MGEs最为丰富。噬菌体相关MGEs与氨基糖苷类、杆菌肽、β-内酰胺类等抗性基因正相关，整合/切除元件（IE）与多药耐药基因正相关，转移相关元件与大环内酯-林可酰胺-链阳菌素（MLS）类抗性基因正相关。

**3.3 病毒群落谱系及其与ARGs和MGEs的关联**
病毒宏基因组分析显示，NMP处理组病毒多样性（Shannon和Simpson指数）显著降低（P<0.05），Andhravirus相对丰度增加，Kayvirus、Peeveelvirus和Takahashivirus减少；预测的毒力噬菌体比例升高（39.24% vs. 34.18%）。病毒多样性与ARGs和MGEs丰度呈负相关（P<0.05）。

**3.4 NMP处理下ARGs、MGEs与微生物属的关联**
共现网络分析表明，Staphylococcus、Psychrobacter和Jeotgalicoccus与氨基糖苷类、杆菌肽、β-内酰胺类抗性基因正相关，且Psychrobacter与噬菌体相关元件和IE元件相关。NMP组中Psychrobacter、Corynebacterium、Jeotgalicoccus与更高的ARG-MGE共定位频率相关，如tet(A)与APH及IS6、IS26、tnpA共定位，fex(B)与Bin3共定位。

**3.5 MGEs与NMP处理下ARG丰度的关联**
结构方程模型（SEM）分析显示，NMP处理对ARG丰度无直接显著效应，但通过Psychrobacter（标准化路径系数0.936）和MGEs（0.926）间接关联。总效应大小：Staphylococcus为0.289，Psychrobacter为0.667，MGEs为0.926，表明MGEs与ARG丰度关联最强。第42天噬菌体滴度（P1和P3）与ARGs或MGEs无显著相关。

**讨论与结论**
讨论指出，含噬菌体粪便输入可能通过裂解敏感宿主细菌（Kill-the-Winner模型）降低微生物多样性，同时释放的胞外DNA可作为水平基因转移（HGT）的底物，促进自然转化和抗性扩散。NMP处理中Psychrobacter等属的富集与ARGs和MGEs共现，提示细菌类群变化可能驱动抗性基因动态。有机质（OM）含量升高可能源于病毒分流（viral shunt）效应，但未直接定量。SEM分析揭示了MGEs和Psychrobacter在ARG积累中的间接作用，但样本量小（<200个）和缺乏噬菌体单独对照限制了推断。未来需通过纯化噬菌体对照和病毒富集测序进一步验证。

研究结论：经口施用噬菌体混合物的鸡可能通过粪便向环境排泄残余噬菌体，潜在地影响局部微生物栖息地。在本研究中，模拟含有残余噬菌体粪便输入的NMP处理与微生物群落多样性降低及ARGs和MGEs相对丰度增加相关。这些变化可能部分与特定细菌属（与ARGs和MGEs相关）的组成变化有关。这些发现表明，含有残余噬菌体的粪便输入可能对粪便系统具有潜在的生态影响，并强调需要针对性策略来评估和减轻与畜牧生产中噬菌体干预措施相关的潜在环境风险。