食用油中黄曲霉毒素B1快速准确检测的双模式筛查系统

《Food Chemistry: X》：Dual-mode screening system for rapid and accurate aflatoxin B1 detection in edible oils

　　

本研究建立了一种将便携式流式细胞仪与UHPLC-QqQ MS/MS集成的双模式系统，用于食用油中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的快速检测。该研究采用竞争性免疫荧光传感器，使用链霉亲和素修饰的磁微球与生物素化的AFB₁-BSA、AFB₁抗体及APC标记的二抗。该方法在0.025–25 ng/g范围内呈线性（R²=0.9966），IC₁₀为0.26 ng/g，IC₅₀为0.76 ng/g。回收率为90.51%–102.73%，精密度≤9.54%。UHPLC-QqQ MS/MS对AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的检出限（LOD）为0.20–0.40 ng/g，定量限（LOQ）为0.50–1.25 ng/g，回收率为88.99%–107.12%，精密度为1.09%–10.58%。通过29种商业油和10批污染花生样品进行验证，市场样品中未检出AFB₁，污染样品中AFB₁含量为1.07–9.36 ng/g，与UHPLC-QqQ MS/MS结果一致。该系统可实现现场高通量筛查，流式细胞术读数速度约为每样本1分钟，批量通量约为32样本/小时（96孔板格式），同时保持实验室级准确度。通过在采样点对大量样品进行高效分流，该策略为加强食用油供应链中的黄曲霉毒素监测提供了一个实用且经济高效的框架。

黄曲霉毒素（aflatoxin）是一类由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的强毒性、致癌性霉菌毒素，在高温高湿条件下易污染油籽及其加工产品。其中，黄曲霉毒素B₁（AFB₁）毒性最强，被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物。欧盟法规（EU）2023/915规定植物油中黄曲霉毒素总量（B₁+B₂+G₁+G₂）限量为4 μg/kg，AFB₁单独限量为2 μg/kg；中国GB 2761-2017规定花生油中AFB₁限量为20 μg/kg。目前主流检测方法存在明显瓶颈：实验室确证方法（如HPLC-FLD、LC-MS/MS）前处理复杂、依赖专业设备，无法现场快速部署；侧向流免疫层析（LFIA）条仅提供定性或半定量结果且通量低；酶联免疫吸附测定（ELISA）操作步骤多、耗时长（常超过1小时）。因此，亟需一种兼具定量能力、高通量和现场便携性的检测策略，以便在监管链中高效分流大量样品。

针对上述问题，研究人员开发并验证了一种双模式筛查系统，将便携式流式细胞仪（MFC）与超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UHPLC-QqQ MS/MS）集成，用于食用油中AFB₁的快速准确检测。MFC作为第一层高通量现场筛选工具，UHPLC-QqQ MS/MS作为第二层确证工具，仅对疑似阳性样品进行多毒素确证分析。实际样品分析表明，该系统能够在采样点快速排除阴性样品，显著降低实验室确证负担，同时确保监管级准确度。该研究发表于《Food Chemistry: X》，为食用油供应链中的黄曲霉毒素监测提供了一种实用、经济高效的解决方案。

研究采用的关键技术方法可概括为：使用甲醇提取和N-丙基乙二胺（PSA）净化处理食用油样品；基于链霉亲和素磁珠偶联生物素化AFB₁-BSA抗原，与游离AFB₁竞争结合AFB₁多克隆抗体，再以APC标记二抗进行荧光标记，通过便携式流式细胞仪（CytoFLEX，重量<15 kg）读取荧光强度并计算抑制率；确证方法采用UHPLC-QqQ MS/MS，使用C18色谱柱梯度洗脱，电喷雾正离子模式多反应监测（MRM）同时检测AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂。验证样品包括29种市售食用油、10批人工污染花生油以及87份现场模拟采集样品。

### 3.1 MFC方法的优化

研究人员采用单因素实验法系统优化了磁珠洗涤次数、磁吸附时间、抗原/抗体/荧光二抗用量、BSA封闭条件、反应温度、时间、反应介质、有机溶剂耐受性、PSA用量及交叉反应性。结果表明，洗涤次数增加会显著降低可检测磁珠数量，最终选择1次洗涤和1分钟磁吸附；5% BSA封闭能减少92%–97%的非特异性吸附；抗原、抗体和荧光二抗的最佳用量分别为50 ng、250 ng和500 ng；抗原-抗体反应在37°C下效率最高，而荧光标记步骤在30°C时信号最强；PBS适用于前两步反应，PBST（含吐温-20的磷酸盐缓冲液）在荧光标记步骤能有效抑制磁珠聚集和非特异性吸附；甲醇浓度高于80%或乙腈浓度高于5%会损害抗体识别；PSA用量为100 mg时可有效消除油脂基质干扰。交叉反应测试显示，该多克隆抗体对AFB₂、AFG₁、AFG₂有40%–87%的交叉反应率，对其他霉菌毒素（如DON、PAT）在低浓度下干扰可忽略，这种设计旨在避免假阴性。

### 3.2 方法验证

在花生油、菜籽油和橄榄油三种基质中，MFC方法对AFB₁的线性范围为0.025–25 ng/g，IC₁₀为0.26–0.34 ng/g，IC₅₀为0.76 ng/g，平均回收率为90.51%–102.73%，日间精密度RSD为4.76%–9.54%。UHPLC-QqQ MS/MS对四种黄曲霉毒素的LOD为0.20–0.40 ng/g，LOQ为0.50–1.25 ng/g，线性范围分别为AFB₁/AFG₁ 1.25–125 ng/g，AFB₂/AFG₂ 0.50–50 ng/g，平均回收率88.99%–107.12%，RSD为1.09%–10.58%。稳健性测试表明PSA用量、孵育时间和温度的微小变化对结果影响小于10%；磁珠-抗原偶联物在4°C储存12个月仍保持良好活性。

### 3.3 实际样品分析

对29种市售食用油（花生油、菜籽油、大豆调和油等）的MFC筛查结果均低于IC₁₀，判定为阴性，经UHPLC-QqQ MS/MS确证所有四种黄曲霉毒素均低于LOD。10批人工污染花生油样品中，MFC全部判定为疑似阳性，UHPLC确证AFB₁含量为1.07–9.36 ng/g，两种方法结果高度一致。质量控制样品和加标实验表明，当样品中同时存在高浓度AFB₂、AFG₁、AFG₂时，MFC会出现正偏差，但所有阳性样品均能被可靠标记，不会漏检，并可通过第二层质谱确证获得精确的各类毒素含量。

### 3.4 与主流快速检测方法比较

与市售LFIA条和ELISA试剂盒相比，便携式MFC方法提供全定量结果，灵敏度优于LFIA（IC₁₀ 0.26–0.34 ng/g vs. 视觉LOD 5 ng/g），通量高（96孔板约1分钟/样本，约32样本/小时），且仪器便携。ELISA虽灵敏度高但需要实验室设备且总耗时超过2小时。双模式系统结合了MFC的现场高通量筛查与UHPLC-QqQ MS/MS的监管级确证能力，优化了资源分配。

### 3.5 对法规合规和实际监测的意义

在10个污染样品中，有7个超过欧盟AFB₁限量2 ng/g，但均未超过中国GB 2761-2017的20 ng/g限量。现场模拟实验在4小时内完成87份样品的筛查，而传统实验室方法需至少5个工作日。该双模式系统可排除超过90%的阴性样品，大幅降低确证仪器负担和监测成本。

### 3.6 局限性与未来展望

研究样本主要来自单一地理区域，且为单实验室验证；深色油脂（如黑芝麻油、紫苏油）未测试。未来研究方向包括开发多毒素同步筛查、实现半自动化或卡盒式系统、引入信号放大策略，以及开展多中心协同验证。

讨论部分指出，该双模式系统通过MFC进行高效初筛、仅对疑似阳性样品进行UHPLC-QqQ MS/MS确证，成功弥合了快速筛查能力与监管确证准确性之间的长期脱节。研究结论翻译如下：本研究开发并验证了一种结合便携式MFC免疫分析与确证性UHPLC-QqQ MS/MS的双模式筛查策略，用于食用油中黄曲霉毒素的快速准确检测。MFC方法对AFB₁的IC₁₀为0.26–0.34 ng/g，IC₅₀为0.76 ng/g，线性范围0.025–25 ng/g，通量约32样本/小时。在三种代表性油脂基质中验证了方法的可靠性，MFC平均回收率90.51%–102.73%，UHPLC-QqQ MS/MS平均回收率88.99%–107.12%，精密度RSD均低于10.58%。对126个实际样品（39个实验室筛选样品和87个现场模拟批次）的分析证明了该策略的实用性，MFC可在4小时内正确识别所有阴性样品，确证工作量减少超过90%。据研究人员所知，这是首次将紧凑型现场可部署MFC平台用于食用油中黄曲霉毒素检测。该双模式系统为食用油中黄曲霉毒素的大规模监管筛查提供了有效、实用的解决方案，在灵敏度、通量和现场适用性之间取得了平衡，弥补了当前食品安全监测体系中的关键空白。