替代蛋白质的半动态体外消化：结构洞察与肽组学

《Food Hydrocolloids》：Semi-dynamic in vitro digestion of alternative proteins: structural insights and peptidomics

　　

本研究调查了各种替代植物蛋白质的体外消化命运。研究人员结合了INFOGEST半动态体外消化模型（INFOGEST semi-dynamic in vitro digestion model）、粒径测定、共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）、ζ-电位（zeta-potential）、圆二色谱（circular dichroism, CD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared spectroscopy, FTIR）、肽组学分析（peptidomics analysis）和计算机模拟生物活性预测（in silico bioactivity predictions），以全面了解大豆分离蛋白（soy protein isolate, SPI）、豌豆分离蛋白（pea protein isolate, PPI）、马铃薯分离蛋白（potato protein isolate, PoPI）、螺旋藻浓缩蛋白（spirulina protein concentrates, SpPC）和大麻分离蛋白（hemp protein isolate, HPI）的微观结构和消化命运。替代蛋白质的缓冲能力、ζ-电位和粒径分布显著影响了蛋白质消化率，进而影响胃排空。此外，SpPC中细胞壁成分的存在影响了胃消化率。研究发现，蛋白质二级结构导致了消化程度的差异；较高的α-螺旋（α-helix）含量与SPI、PPI和PoPI的高消化率相关，而较高的β-折叠（β-sheet）比例与HPI的低消化率相关。肽组学分析显示，SpPC在胃肠道消化后释放的肽数量最多，而HPI产生的肽最少。计算机模拟生物活性预测强调，无论测试的替代蛋白质类型如何，血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme, ACE）抑制、抗氧化和二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase, DPPIII和IV）抑制是主要的生物活性。总体而言，不同来源的替代蛋白质表现出多样化的消化命运和蛋白水解谱，这主要受其结构特性的支配。

**论文解读：替代蛋白质的半动态体外消化——结构洞察与肽组学分析**

**研究背景与问题**

随着消费者对人为温室气体排放和动物蛋白伦理问题的关注日益增加，替代蛋白质（alternative proteins, APs）在全球范围内受到广泛关注。然而，与动物蛋白（90–95%）相比，APs的消化率较低（75–80%），且蛋白质消化率校正氨基酸评分（protein digestibility-corrected amino acid score, PDCAAS）也较低，导致营养等价性不足。近期研究已建立食物蛋白质分子结构特征与消化率之间的直接关联：常规动物蛋白（如肉、蛋、奶）具有更开放的结构构象，消化特性较好；而APs多为储存蛋白，具有复杂球状结构，含疏水核心，在消化过程中不易被酶解。此外，APs还面临抗营养因子和包裹细胞壁结构等消化障碍。商业提取和脱水过程可能暴露更多疏水氨基酸残基，热加工导致二硫键交换、侧链修饰和聚集，进一步阻碍酶解。APs的消化抗性还与其致敏潜力相关，即产生抗性肽。尽管已有研究表明APs衍生肽具有生物活性，但水解程度和消化产物在很大程度上取决于蛋白质的内在特性和加工条件。植物蛋白消化率变异大（如豌豆蛋白54–84%），增加了研究间比较的不确定性。以往研究多采用静态INFOGEST方法，但静态模型无法复制人体消化的动态特性，特别是胃消化阶段在控制营养吸收速率中的关键作用（如胃渐进酸化、持续分泌胃液和酶、蛋白质结构变化及胃排空）。因此，需要更动态、更具生理相关性的消化模型。半动态INFOGEST消化模型是经过验证的方法，能简化复杂动态模型，重点关注胃消化相的关键动力学。本研究假设：APs的二级结构直接影响其胃肠道消化及生物活性肽的释放。研究目的是通过半动态体外消化模型，评估不同来源APs（大豆、马铃薯、大麻、螺旋藻和豌豆）的消化动力学、理化特性、微观结构、二级结构及计算机模拟生物活性肽谱，以深入了解结构构象在胃肠道转运中如何影响消化率和命运。该论文发表在《Food Hydrocolloids》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用INFOGEST半动态体外消化模型，模拟胃渐进酸化和胃排空（基于能量密度计算胃排空时间），并结合动态光散射（DLS）测定粒径与ζ-电位、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察微观结构、圆二色谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析二级结构、纳米液相色谱-串联质谱（NanoLC-ESI-MS/MS）进行肽组学分析，以及计算机模拟（PeptideRanker和BIOPEP数据库）预测生物活性。样本来源为商业供应商：大豆分离蛋白（SPI）、螺旋藻浓缩蛋白（SpPC）、马铃薯分离蛋白（PoPI）、豌豆分离蛋白（PPI）和大麻分离蛋白（HPI）。

**研究结果**

**3.1 体外半动态胃消化特性**
通过监测胃消化过程中pH变化和沉淀现象，发现不同APs的缓冲能力差异显著。PPI和PoPI在胃消化初期维持较高pH（>5.0），高于其等电点（pI），导致胃排空延迟；SPI在pH接近pI时出现明显沉淀，随后随pH下降而解聚；SpPC和HPI的pH迅速降至pI以下，缓冲能力有限，SpPC的沉淀与细胞壁成分相关，HPI则呈现抗消化特性。

**3.2 AP消化物的微观结构演变**
CLSM图像显示，SPI在胃消化初期呈球状颗粒，pH低于pI后解聚；PPI和PoPI在胃消化中呈现紧凑网络结构，PPI在胃末期出现酸诱导融合；SpPC保持螺旋状细胞壁结构，胃消化后细胞壁清晰可见，限制酶解；HPI在整个胃消化和肠消化初期保持大而致密颗粒，抵抗水解。

**3.3 Zeta电位演变**
ζ-电位测量表明，SPI、PPI和PoPI随pH下降从负值变为正值（如SPI从?25 mV升至+25 mV），与氨基酸质子化和酶解相关；HPI和SpPC在整个胃消化中保持负电位，HPI的负电位归因于盐浓度引起的静电屏蔽效应，SpPC的负电位与细胞壁成分和pH低于pI相关。肠消化阶段所有样品均呈负电位。

**3.4 APs的二级结构**
CD和FTIR分析显示，未消化时，PoPI和SpPC富含α-螺旋（54%和55%），SPI和PPI以随机卷曲为主（47%和52%），HPI几乎完全由β-折叠（平行和反平行）和β-转角构成（100%）。胃消化后，SPI和PoPI的α-螺旋含量显著增加（17%→73%和54%→93%），β-折叠减少，表明酶解导致结构展开；HPI的β-折叠构象在消化全程保持80–90%，且FTIR显示强氢键信号，证明其有序结构限制酶解。

**3.5 体外蛋白质消化率和蛋白谱**
SDS-PAGE和OPA法测定消化率显示：SPI最高（86%），PPI 62.5%，PoPI 57.7%，SpPC 51%，HPI最低（33.1%）。SDS-PAGE谱显示，SPI中β-伴大豆球蛋白（7S）在胃消化后期完全水解，大豆球蛋白（11S）部分水解；PPI中豌豆球蛋白、伴豆球蛋白和豆球蛋白水解明显；PoPI中patatin逐步水解，但胰蛋白酶抑制剂条带持续存在，降低消化率；SpPC中藻胆蛋白条带在胃消化后消失，但低消化率与细胞壁阻碍相关；HPI中edestin亚基（酸性α和碱性β）在整个胃消化中稳定存在，肠消化后期才出现少量水解。

**3.6 消化产物的肽组学分析**
NanoLC-MS/MS鉴定肽段数量：SpPC最多（11,839），其次PPI（4,768）、PoPI（2,939）、SPI（2,241）、HPI（2,118）。Venn图和UpSet图显示，SPI、PPI和HPI之间共享146个肽段，这与它们含有同源11S储存球蛋白一致。肽长度分布表明，胃消化阶段以11–15个氨基酸（AA）肽为主（42–52%），肠消化阶段短肽（6–10 AA）比例增加。SPI和PPI产生最多短肽（52%和64%），SpPC和HPI保留较多长肽（11–15 AA占35–49%），反映水解程度低。生物活性预测显示，SPI生物活性肽比例最高（14%），HPI虽低消化率但生物活性肽比例较高（4%），主要活性包括ACE抑制、抗氧化、DPPIII/IV抑制等。各APs还特有某些活性，如HPI具抗遗忘活性，PoPI具神经保护活性等。

**讨论与结论翻译**

**讨论总结**
本研究揭示了不同来源APs的结构-消化功能关系。SPI因缓冲能力适中、二级结构展开明显（α-螺旋增加）而表现最高消化率；PPI和PoPI因缓冲能力强、胃消化初期pH较高而延迟胃排空，但消化率接近；HPI因富含β-折叠、强氢键作用而极度抗消化；SpPC因细胞壁阻碍酶解，虽释放大量肽段但水解不完全。肽组学分析证实，消化率高的APs产生更多短肽和更高比例生物活性肽，但HPI例外，其低消化率却产生较高比例生物活性肽，表明消化率与生物活性肽产量并非线性关系。研究为未来通过结构修饰（如发酵、挤出、细胞壁破坏）改善低消化率APs的功能性提供了基础。

**研究结论翻译**
本研究为不同来源（豆类、块茎、单细胞）的替代蛋白质提供了结构-消化功能关系的全面洞察。在半动态体外蛋白质消化中，SPI表现出优越的胺基释放和蛋白质消化率（86%），优于所有蛋白质。PPI和PoPI表现出几乎相似的消化率（62.5%和57.7%），以及可比的氨基酸可利用性和肽段大小分布。相比之下，HPI由于复杂的二级结构构象（主要由β-折叠和β-转角组成）而经历有限的蛋白质消化率（33.1%）。尽管SpPC因细胞壁干扰胃蛋白酶释放而释放的肽段数量多于其他蛋白质，但HPI在胃肠道消化后仅释放74个肽段。然而，这两种蛋白质的肽长度分布高于其他测试的蛋白质提取物（SPI、PPI、PoPI），证实了胃肠道酶的作用减弱，从而导致SpPC和HPI的功能性较低。所有测试的APs均表现出不同的生物活性潜力。这些消化差异与胃肠道消化过程中发生的微观结构变化密切相关，本研究首次全面报道了这一点。研究结果也为未来开发靶向结构修饰和加工策略以改善低消化率替代蛋白质的功能性提供了基础。生物化学方法，包括翻译后修饰、受控水解、发酵、挤出和细胞壁破坏，可用于改变蛋白质结构、增加酶可及性并提高蛋白质消化率和生物活性肽的释放，特别是针对HPI和SpPC。这些策略有助于开发更具功能性的替代蛋白质成分。总体而言，本研究为替代蛋白质的消化行为提供了有价值的见解，为可持续和健康食品开发奠定了基础。