基于图的对比学习实现了跨单细胞和空间多组学的统一整合与生态位迁移

《Briefings in Bioinformatics》：Graph-based contrastive learning enables unified integration and niche transfer across single-cell and spatial multi-omics

　　

摘要 单细胞和空间组学的快速增长超过了能够将数据统一到一个连贯框架中用于组织图谱构建和跨样本分析的计算方法的发展速度。一个关键的瓶颈在于现有工具无法将来自不同技术——涵盖转录组学、表观组学和蛋白质组学——的细胞共嵌入到一个共享的参考空间中，同时保持空间结构和分子特异性。在此，我们提出了 Garfield（基于图对比学习实现快速单细胞嵌入），这是一个几何深度学习框架，通过具有空间或分子感知的细胞嵌入来解决这些挑战。利用图对比学习框架，Garfield 学习了由不同技术生成的数据的共享嵌入空间，实现了空间参考图谱的无缝构建和查询。我们的结果显示，Garfield 在多个数据集上识别空间生态位方面 consistently 优于最先进的基准模型。我们进一步通过将 Garfield 应用于多模态空间数据（包括基因表达和染色质可及性）来展示其通用性，并成功识别了小鼠大脑中的不同生态位。值得注意的是，Garfield 揭示了非小细胞肺癌和乳腺癌中的肿瘤微环境异质性，发现了在肿瘤边缘保守的屏障状免疫生态位，这些生态位协调了 CD80 介导的 T 细胞-B 细胞-树突状细胞相互作用以及 IFN-γ/B 细胞激活通路，形成了空间协调的免疫监视中心。这些发现强调了 Garfield 通过提供一种稳健、可扩展的解决方案来整合和解释跨不同组织类型和模态的复杂空间数据，从而推进空间组学研究的潜力。

引言 单细胞组学的最新进展使得个体和整合的细胞图谱成为可能。单细胞多组学技术现在能够同时测量多个细胞层，例如转录组学、表观组学和蛋白质组学，显著增强了我们对细胞状态以及发育和疾病潜在分子机制的理解。例如，CITE-seq [1] 和 REAP-seq [2] 能够同时检测单细胞中的 RNA 表达和表面蛋白丰度，而 SNARE-seq [3]、SHARE-seq [4]、10x Multiome (https://www.10xgenomics.com/products/) 和 ISSAAC-seq [5] 提供了来自同一细胞的 RNA 表达和染色质可及性信息。基于这些进展，空间转录组学作为一种强大的方法应运而生，它在组织空间背景下映射基因表达，增加了一层新的信息。随着扩展到空间多组学，研究人员现在可以同时分析单个组织切片中的多个组学层（例如转录组学、表观组学），捕捉互补的生物学见解。当前的空间技术大致分为基于测序的方法 [6–10]，通过捕获和测序 RNA 来推断空间信息，以及基于成像的方法 [11–13]，使用显微镜直接可视化 RNA 分布，每种方法都解锁了每个细胞的多维度、空间分辨率的视角。

尽管具有变革潜力，但在最大化这些技术效用的计算挑战依然存在。单细胞多模态数据的集成方法通常依赖于识别“锚点”来对齐数据集，无论是显式还是隐式。基于锚点的选择，集成方法通常分为水平、垂直和对角集成 [14]。我们专注于最先进的水平和垂直集成算法。水平集成，如 Seurat v3 的 CCA [15]、MultiVI [16]、Multigrate [17] 和 MOFA+ [18]，使用共享模态来链接具有不同细胞的数据集。相反，垂直集成跨组学层对齐数据集，例如 Seurat v4 的 WNN [19] 和 MultiVI [16] 所示。用于识别细胞生态位的空间计算方法，如 GraphST [20]、STAGATE [21]、CellCharter [22]、SPACE [23] 和 NicheCompass [24]，也已经开发出来，然而这些是专门为空间转录组数据设计的。因此，集成或分析单细胞或空间转录组数据通常需要多个工具，增加了用户的工作量。此外，当前方法大多缺乏功能来充分利用单细胞内细胞特征和多模态之间的关系。很少有工具支持单细胞和空间多组学数据的联合分析，同时保持分子特异性和空间拓扑，这是构建全面组织图谱的关键要求。更广泛地说，图神经网络 (GNNs) 和对比目标越来越多地用于生物信息学，包括药物 - 靶点相互作用预测 [25]、多标签 mRNA 定位 [26]、RNA 结构和序列建模 [27, 28] 以及图引导的组合优化 [29]。与此同时，用于非配对或不完整组学的生成模型 [30] 解决了在未观察到每个分子层时学习连贯表示的相关但不同的挑战。这些发展促使了基于图、对比和变分框架的发展，而缺失模态恢复仍然是一个单独的任务，需要专门的屏蔽和验证协议。

为了克服这些局限性，我们提出了 Garfield（基于图对比学习实现快速单细胞嵌入），这是一个通用的嵌入框架，将异质的单细胞和空间（多组学）数据集统一在一个共享的潜在空间中，支持各种分析任务。与专门设计用于单细胞或空间数据的现有方法不同，Garfield 同时处理这两种数据类型，无论模态如何。Garfield 构建了一个统一的观测图，其节点表示细胞或空间单位，其边编码分子或空间关系。通过利用变分图自编码器 (VGAE) [31] 以及基于奇异值分解 (SVD) 的对比策略和可选的基于最大均值差异 (MMD) 的对齐，Garfield 将细胞嵌入到低维、批次不变的生物空间中，从而在单细胞或空间水平上实现批次校正和多组学集成。受架构手术 [32] 的启发，Garfield 进一步实现了权重受限微调，以将新数据集映射到单细胞或空间参考图谱。

Garfield 的统一框架支持包括 (i) 降维；(ii) 批次校正和多模态集成；(iii) 空间数据中的生态位发现；和 (iv) QueryToReference 映射的任务。其跨任务的适应性是通过调整从单细胞或空间数据构建的输入图来实现的。在多个单细胞多组学、空间单模态和双组学数据集上的广泛测试证明了 Garfield 的稳健性能，要么超越要么匹配当前最先进的方法。此外，Garfield 高效地扩展到大型空间数据集，通过小批量处理实现了跨越近一百万细胞的综合图谱构建。最后，我们开发了一个全面的、可扩展的 Python 包，具有无缝的工作流程，用于数据预处理、图构建、使用 PyTorch 进行图嵌入训练以及事后分析可视化。Garfield 与流行的单细胞工具 (Scanpy) [33] 和空间工具 (Squidpy) [34] 兼容，并在 https://garfield-bio.readthedocs.io 提供详细的文档和教程。

结果
Garfield 概览
Garfield 是一种通用的嵌入算法，旨在支持对单细胞或空间数据进行单模态和多模态格式的高分辨率分析（图 1）。通过整合多组学测量与可选的空间信息，当空间坐标可用时，Garfield 表征组织样本内的分子景观和空间生态位。其灵活的输入包括分割细胞或捕获位置（如珠子、像素、二进制或点）的特征矩阵，以及空间坐标。因为建模的单位可以是细胞、分割的子细胞对象、珠子、二进制或点，具体取决于平台，我们使用“观测”作为通用术语，“空间单位”用于空间测定。我们将“细胞”保留给单细胞分辨率测量或平台分辨率明确的情况下，与“方法”部分中使用的 Nobs 表示法一致。

图 1 Garfield 框架概览：Garfield 接收单细胞和空间组学数据的单模态或多模态数据，包括转录组学、表观组学、蛋白质组学和空间信息，构建分子和空间图，使用图对比变分图自编码器框架内的图神经网络学习批次不变和空间感知的嵌入，并支持细胞图谱构建、生态位发现、多切片集成和生态位转移；由 BioRender.com 创建。

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Garfield 采用 VGAE [31] 框架，使用自监督、多任务学习方法将观测嵌入到空间和分子连贯的潜在空间中。对于单细胞数据，Garfield 构建分子邻域图，节点表示细胞，边表示分子相似性。对于空间数据，它使用细胞或点坐标构建空间邻域图，其中边捕捉空间单位之间的空间关系。每个节点编码一个表示组学数据的特征向量，例如在单模态分析中的基因表达，或在多模态设置中与染色质可及性峰或抗体配对的基因表达。与之前的方法 [23, 35]（依赖于单一图类型（分子图或空间图））不同，Garfield 同时集成模态内分子图、模态间分子图和（如果可用）来自空间坐标的空间图。

为了实现空间和分子集成的潜在表示，Garfield 提供了几种 GNN 编码器（GATv2 [36]、GAT [37] 和 GCN [38]）。为了增强生物信号同时最小化噪声，Garfield 结合了奇异值分解的稀疏近似 (approxSVD) 对比学习 [39] 策略，最大化原始节点视图和去噪节点视图之间的互信息 (MI)。与传统依赖编码器估计数据均值和方差的变分自编码器不同，Garfield 的编码器仅学习均值，方差基于该均值通过额外的全连接层计算。这种自适应方差缩放根据每个节点调整对比损失，本质上反映了细胞间的生物变异。此外，为了减轻批次效应，Garfield 应用 MMD [40] 损失作为对齐策略，这在批次校正中得到了广泛使用 [32, 41]。

在解码阶段，Garfield 通过多个模块重构空间和分子信息。图解码器对齐样本特定的潜在表示以通过边重构损失重构空间图，通过强制邻近节点之间的相似性来保持空间结构。对于分子信息，Garfield 利用由内积模块和特征重构模块组成的组学解码器来优化组学特征恢复。

本质上，Garfield 的综合框架是一个扩展的多模态图变分自编码器。这种设计使得能够精确表征单细胞景观和组织特异性生态位，为单细胞和空间组学数据分析提供了通用、端到端的框架。

单细胞多组学集成中 Garfield 的基准测试
单细胞多组学技术使研究人员能够整合基因组信息，提供对细胞功能 [19]、基因调控 [42] 和精确命运预测 [43, 44] 的见解。为了评估 Garfield 在单细胞多组学集成中的性能，我们在九个 scRNA + scATAC 数据集上将其与四种广泛使用的算法——Seurat V4、MultiVI、MOFA+ 和 Multigrate——进行了比较（图 2a–c，补充表 S1）。聚类使用 Leiden 算法执行，使簇的数量与真实细胞类型相匹配。性能使用四个指标进行评估：调整兰德指数 (ARI)、标准化互信息 (NMI)、细胞类型平均轮廓宽度 (cASW) 和细胞类型分离局部逆辛普森指数 (cLISI)。生物变异保守分数计算为这些指标的平均值，用作整体性能指标。

图 2 Garfield 在单细胞和空间多模态集成中优于现有最先进的方法：(a–c) cLISI、cASW、NMI、ARI 和生物变异保守分数比较了五种集成方法在九个配对单细胞 RNA 和 ATAC 数据集上的表现，a 和 b 中的数据表示为均值 ± 标准误，c 中的数据表示为均值及 95% 置信区间（?N=9 个数据集）；(d–f) 相应的分析比较了五种方法在五个配对单细胞 RNA 和蛋白质数据集上的表现，数据表示为均值及 95% 置信区间（?N=5 个数据集）；(g,h) Allen 小鼠脑图谱的标注冠状切片和相应的 Garfield 衍生的空间生态位显示尾壳核 (cp)、大脑皮层 (ctx)、胼胝体膝部 (ccg)、前连合、嗅束 (aco)、前扣带区 (aca)、伏隔核 (acb)、外侧隔核 (ls)、侧脑室 (vl)、外侧前视区 (lpo) 和 Caleja 主要岛 (islm)；(i) ARI、NMI、AMI、HOM 和 ASW 比较了 Garfield、SpatialGlue、MOFA+、NicheCompass 和 MultiVI；以及 (j) 相同的指标比较了 RNA、ATAC 和联合 RNA-ATAC 表示。

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Garfield 获得了最高分，包括平均 ARI 0.59，NMI 0.71，cASW 0.59，和 cLISI 0.98（图 2a 和 b）。Seurat V4 也表现良好，ARI 为 0.53，NMI 为 0.71，cASW 为 0.63，和 cLISI 为 0.99，使得 Garfield 和 Seurat V4 的生物变异保守分数分别为 0.716 和 0.718，优于 MultiVI (0.681)、Multigrate (0.626) 和 MOFA+ (0.668; 图 2c)。Garfield 进一步与 Seurat V4、TotalVI、scArches 和 Multigrate 一起在五个 scRNA + scADT 数据集上进行了评估（补充表 S2）。Garfield 显示了最高的平均 ARI (0.57)、NMI (0.63; 图 2e)，以及优越的生物变异保守性（Garfield: 0.68; Seurat V4: 0.63; TotalVI: 0.59; scArches: 0.59; Multigrate: 0.60; 图 2f）。各种算法在不同数据集上的详细性能指标在图 S1 中展示。为清晰起见，我们突出展示了一个代表性数据集，展示了 Garfield 从平行单细胞 RNA-ATAC 或 RNA-ADT 数据集中捕获跨模态表示的能力（图 S2 和 S3）。

总体而言，全面的基准测试表明 Garfield 在集成单细胞多组学（scRNA + scATAC 和 scRNA + scADT）方面优于或匹配当前主流工具。

空间多组学集成中 Garfield 的基准测试
在单细胞转录组学的成功之后，空间转录组学代表了生物样本分析的下一个前沿 [45]。

随着空间技术的进步，现在可以在单个组织切片上同时分析多个组学层 [46]。值得注意的是，Garfield 也适用于整合空间多组学数据。为了评估 Garfield 的能力，我们使用小鼠大脑表观基因组 - 转录组数据集将其与竞争方法——NicheCompass、SpatialGlue、MultiVI 和 MOFA+——进行了基准测试。使用 Allen 大脑图谱参考来注释解剖区域，如前扣带区 (aca)、皮层层 (ctx)、胼胝体膝部 (ccg)、外侧隔核 (ls)、主要卡列哈岛 (islm) 和伏隔核 (acb; 图 2g 和 h)。观察到每个解剖区域都有独特的空间分布，且子组件之间具有清晰的一致性 (图 S4a 和 b)。基准测试包括在各方法整合结果上应用不同分辨率的 Leiden 聚类，以尽量减少分辨率参数带来的偏差 (方法)。空间生态位检测的性能使用五项指标进行评估：ARI、NMI、调整互信息 (AMI)、同质性 (Homo) 和生态位平均轮廓宽度 (ASW)。Garfield 的表现优于竞争对手，在这些指标上相比第二好的方法分别提升了 59.7%、48.5%、48.7%、48.0% 和 9.0%，平均提升 42.78% (图 2i)。通过统一流形近似与投影 (UMAP) 和空间可视化的定性评估表明，Garfield 在识别空间生态位方面具有优越的能力 (图 S4c–e)。虽然 MultiVI 和 MOFA+ 等单细胞多组学方法难以区分生态位，且 NicheCompass 和 SpatialGlue 等空间多组学方法在精细组织生态位 (如 islm) 中表现有限，但 Garfield 有效地解析了详细的生态位结构，包括 ctx 层、ccg/aco、ls、acb 和 vl。重要的是，Garfield 唯一识别了 islm 复杂的生态位结构，而竞争算法未能检测到。此外，我们的研究结果表明，Garfield 通过有效整合多模态信息超越了单模态方法，从而提高了表示学习的质量 (图 2j)。此外，Garfield 在不同邻居数量和随机种子下表现出稳健的性能 (图 S5)。这些结果强调了 Garfield 在跨模态表示、空间生态位识别和下游可视化方面的潜力，确立了其作为空间多组学整合强大工具的地位。Garfield 在组织生态位检测中优于最先进工具 为了评估 Garfield 在组织生态位识别中的性能，我们将其与其他空间表示方法进行了比较，包括 NicheCompass [24]、CellCharter [22] 和 GraphST [20]，重点关注细胞表示和生态位标签。基准测试在小鼠海马体的 Slide-seqV2 数据集上进行，该数据集以其定义明确的空间组织组织而闻名，与解剖结构紧密吻合 [6]。由于该数据集缺乏真实标签，我们将从 Allen 小鼠大脑参考图谱 [47] 获取的解剖图与手动识别的生态位进行了定性比较 (图 3a)。这些生态位与解剖子组件显示出强烈的对齐性，准确反映了局部组织结构 (图 3b)。手动注释的生态位显示出独特的空间分布 (图 S6a)，并与已知标志物相关 (图 S6b)，验证了其作为基准测试伪真实标签的用途。此外，具有相似解剖结构的生态位表现出可比的细胞类型丰度变化 (图 S6c)，表明细胞类型组成的差异，而不仅仅是基因表达，促成了生态位内的生物变异。图 3 Garfield 在不同技术和组织间准确识别生态位：(a,b) 来自 Allen 小鼠大脑参考图谱的解剖注释和手动定义的海马生态位代表了胼胝体、外侧后丘脑核、分层、内侧和外侧缰核、髓纹、齿状回、CA1、CA2、CA3 和第三脑室；(c–e) ARI、NMI、AMI、HOM 和 ASW 评分、UMAP 嵌入和空间图比较了 Garfield 与 NicheCompass、CellCharter 和 GraphST；(f) 小鼠嗅球参考显示了脑膜、ONL、GL、EPL、MCL、IPL、GCL 和 RMS；(g,h) 展示了 Stereo-seq 和 Slide-seqV2 小鼠嗅球切片的 Garfield 衍生生态位；(i,j) CHAOS 评分比较了生态位分辨率，每个面板中指示了所选分辨率；(k) 通过微调和其他 niche 标签转移，将 Slide-seqV2 查询映射到 Stereo-seq 参考；以及 (l,m) 展示了代表性细胞类型的生态位间估计细胞类型比例及其空间分布。在新标签页中打开下载幻灯片使用 ARI、NMI、AMI、HOM 和 ASW 作为评估指标，我们将 Garfield 与竞争工具进行了基准测试。Garfield 在这些指标上一致优于所有方法 (图 3c–e)。虽然所有方法都能区分 CA1、CA2、CA3 和 DG 等主要结构，但 GraphST 难以解析 LP 和 Stratum 等更精细的生态位结构。NicheCompass 难以识别胼胝体，并表现出潜在的过度分割，特别是在 LP 生态位中。CellCharter 和 Garfield 都认为 LP 可能是同质的，但 CellCharter 在 Stratum 上的表现明显弱于 Garfield。Garfield 提供了最稳健的结果，准确表征了小鼠海马体中所有生态位的空间分布。这些发现证明了 Garfield 在检测组织生态位方面的优越能力。使用 Stereo-seq 和 Slide-seqV2 绘制小鼠嗅球中共享和独特空间生态位的图谱 Garfield 在不同空间测序平台上识别生态位的能力通过使用 Slide-seqV2 [6] 和 Stereo-seq [7] 分析的两种小鼠嗅球 (MOB) 空间转录组切片得到了证明 (图 3f–j)。基于 DAPI 染色图像 [48] 和 Allen 小鼠大脑图谱注释 [47]，Garfield 准确解析了已知的组织结构，包括嗅神经层 (ONL)、肾小球层 (GL)、外丛状层 (EPL)、僧帽细胞层 (MCL)、颗粒细胞层 (GCL)、内丛状层 (IPL) 和向头迁移流 (RMS) (图 3f)。值得注意的是，Garfield 在 Slide-seqV2 数据中检测到了更精细的生态位结构，例如将 EPL 细分为 EPL_inner 和 EPL_outer。这种差异可能反映了 Slide-seqV2 更高的捕获分辨率，突出了 Garfield 辨别详细空间结构的能力。识别出的生态位表现出特定的空间分布和独特的标志基因表达 (图 S7)。例如，生态位 10 (Slide-seqV2) 富含 Ptgds [49] (脑膜 [50])，生态位 4、9 (ONL) 富含 S100a5 [51]，生态位 6 (IPL) 富含 Slc17a7 [52]，生态位 7 (RMS) 富含 Mbp [53]。定量分析 [52] 证实了这些模式，显示 Garfield 识别的生态位在跨平台时具有更好的空间连续性和平滑性，无论分辨率如何 (图 3i 和 j)。为了解决空间组学数据集之间生态位的可转移性，Garfield 使用 Stereo-seq 数据作为参考，Slide-seqV2 数据作为查询。Garfield 有效地将生态位标签从参考转移到查询，在潜在空间中保持了一致性 (图 3k)。这一结果表明 Garfield 具有跨数据集注释迁移的潜力，揭示了测序技术之间保守的生态位。此类发现为构建全面的 3D 空间图谱铺平了道路。此外，我们使用来自 GSE121891 [51] 的公开可用 MOB scRNA-seq 数据探索了不同生态位中的细胞类型富集。映射到 Stereo-seq 数据的细胞类型注释揭示了独特的生态位特异性特征，包括相邻层中的神经元亚型、ONL 中的间充质细胞亚群以及 RMS 中的少突胶质细胞前体细胞 (图 3l 和 m)。这些发现进一步证明了 Garfield 在揭示组织内复杂空间和细胞关系方面的效用。使用 Garfield 揭示 NSCLC 肿瘤微环境中的异质性 为了证明 Garfield 在大规模癌症数据集中解析肿瘤微环境异质性的能力，我们将其应用于一个人非小细胞肺癌 (NSCLC) 数据集，该数据集由来自五名捐赠者的八个组织切片 (702 199 个细胞) 组成，其中两名捐赠者分别有两个或三个技术重复。使用除捐赠者 13 (625 663 个细胞) 之外的所有样本构建了 NSCLC 的空间图谱。Garfield 识别出 16 个由差异细胞组成 (图 4a, 图 S8b 左) 和空间组织 (图 S8b 右) 驱动的独特生态位。识别出几个肿瘤特异性生态位 (如生态位 0、1、5、9 和 13) 为捐赠者特异性但在技术重复间共享，表明使用 Garfield 消除了批次效应 (图 4c, 图 S8b)。值得注意的是，生态位 7 在所有捐赠者中都发现，特别是捐赠者 6 和 9，并定义为捐赠者共享生态位。它在组织学图像中表现出独特的空间分布，并富集在上皮细胞和髓系细胞中 (图 4d 和 e)。此外，观察到了捐赠者特异性生态位，如生态位 1 (特定于捐赠者 6, 图 4f) 和生态位 13 (特定于捐赠者 12, 图 4h)。空间位置和邻居细胞组成证实了这些发现 (图 4g, 图 4i)。确定了驱动这些生态位的关键核心基因，包括捐赠者 6 特异性生态位 1 中的 EGFR (图 S8c) 和捐赠者 12 特异性生态位 13 中的 S100A6 (图 S8d)。其他生态位，如生态位 2，与肿瘤相关成纤维细胞和中性细胞共同富集，表明它们与肿瘤进展相关 (图 S8a 和 b)。跨生态位的细胞类型比例分析揭示，每个生态位都可以由一个显著富集的细胞类型进行注释，展示了 Garfield 突出 NSCLC 肿瘤异质性的能力 (图 4j)。这些发现得到了使用 Ro/e 进行偏好分析的进一步支持 (图 S8e)。图 4 Garfield 构建了异质性非小细胞肺癌患者的空间图谱并表征了生态位间细胞丰度和基因特征的差异：(a–c) UMAP 显示主要细胞类型、16 个 Garfield 衍生生态位以及捐赠者或重复来源；(d,e) 细胞类型和样本组成以及组织图表征了捐赠者共享生态位 7；(f,g) 相应的分析表征了 Lung 6 特异性生态位 1；(h,i) 相应的分析表征了 Lung 12 特异性生态位 13；(j) 气泡图总结了跨生态位的细胞类型分布和丰度，气泡大小代表细胞比例，生态位身份由类别指示；(k–n) UMAP 显示参考图谱、保留的捐赠者 13 查询的映射、其原始主要和次要细胞类型以及转移的生态位分配；(o) 桑基图追踪查询肿瘤细胞到转移的生态位；以及 (p) 观察值与期望值比率显示跨转移生态位的优先细胞类型定位，大于 1 的值表示富集。在新标签页中打开下载幻灯片为了评估 Garfield 的空间参考映射能力，我们使用了新捐赠者 (捐赠者 13) 的数据，并使用最小权重限制微调将其映射到构建的空间参考上。在 Garfield 的潜在空间上训练的 k 近邻分类器将生态位标签转移到查询细胞上，在保留生物特征的同时实现了准确集成 (图 4k–n, 图 S8f)。标签转移识别出参考之外的捐赠者 13 特异性生态位，与肿瘤相关生态位密切相关，并具有 consistent 的细胞类型分布 (图 4k–o)。(注：此处 consistent 意为一致的)。这表明 Garfield 能够在保持参考和查询数据集之间相关性同时检测新的空间变异。总之，这些结果突出了 Garfield 构建大规模空间参考图谱并通过最小微调将查询空间数据集映射到单细胞分辨率空间图谱的能力，使得在复杂数据集中发现新的空间模式成为可能。Garfield 在人类乳腺癌 10x Xenium 数据中识别异质性生态位 使用 Garfield，我们分析了使用 10x Xenium 技术分析的人类乳腺癌 (BC) 数据集，以揭示肿瘤模块化组织以及肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用。Garfield 有效捕获了生物变异并整合了来自同一组织的重复样本 (图 5a–c)。通过在 Garfield 的潜在空间上应用 Leiden 聚类，我们识别出 14 个具有清晰边界且独立于空间分辨率的独特生态位 (图 S9a)。对生态位的仔细检查表明，每个生态位都由独特的细胞类型组合组成，突出了它们的异质性 (图 5a 和 b, d 和 e, 图 S9e)。例如，生态位 1 和生态位 8 分别主要富集了侵袭性和增殖性肿瘤细胞，在重复样本间显示出相似的空间分布 (图 5d 和 e)。我们还观察到免疫细胞，如 T 细胞、B 细胞和树突状细胞 (DCs)，在生态位 3、4 和 12 中普遍存在，表明与肿瘤发展密切相关。这些生态位得到了已知标志基因富集的进一步支持，验证了分层结构 (图 S9b)。

图 5 Garfield 识别了人类乳腺癌中具有独特空间意义的功能不同微环境：(a–c) 两个整合的 313 探针 10x Xenium 组织重复样本的 UMAP，按原始细胞类型、14 个 Garfield 衍生的微环境及数据来源分组；(d,e) 空间图谱显示两个重复样本中的原始细胞类型和 Garfield 微环境；(f) 气泡图总结了跨微环境的细胞类型丰度，气泡大小表示细胞比例，微环境身份由类别指示；(g) 树状图将分子相似的微环境分组；(h) 箱线图显示淋巴相关微环境中 25 个最近邻细胞的组成，中线表示中位数，箱体表示四分位距，须延伸至 1.5 倍四分位距，仅显示平均贡献为 5–60% 的细胞类型；(i) 热图显示微环境 3 内的近端细胞间相互作用，通过置换检验评估显著性 (n=1000)：* P < .05, ** P < .01, *** P < .001；(j,k) 空间图谱显示肿瘤特异性和淋巴相关微环境以及浸润性肿瘤细胞、CD8 阳性 T 细胞、CD4 阳性 T 细胞和 IRF7 阳性树突状细胞在肿瘤边界的相对密度；(l) 散点图比较跨微环境的传入和传出相互作用强度；(m) 网络图显示 CD80 信号相互作用，箭头粗细表示相互作用强度；(n,o) 富集分析显示与微环境 3 和 12 相关的分子通路和生物过程。在新标签页中打开下载幻灯片

我们进一步探索微环境内的细胞组成，并基于 Garfield 潜在变量进行层次聚类（图 5f 和 g）。层次聚类将具有相似细胞类型组成和基因特征的微环境分为不同区室，例如 lymphoid_cluster_I（微环境 3、4 和 12）、lymphoid_cluster_II（微环境 10 和 11）、Invasive_tumor_cluster（微环境 1 和 8）等（图 5g）。对于淋巴簇，我们进行了邻域组成分析，并确认了淋巴簇内一致的细胞类型共定位（图 5i），这与之前的观察一致（图 5a 和 b）。为了进一步探索淋巴微环境的功能动态，我们为微环境 3、4 和 12 构建了近端相互作用网络（方法）。在这三个微环境中鉴定出 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与基质细胞之间的强相互作用（图 5i，图 S9c 和 d），而微环境 12 还显示了 B 细胞与免疫/基质细胞之间的额外串扰，这可能是由于其高 B 细胞富集所致（图 S9d）。鉴于先前的证据表明肌上皮细胞可以形成屏障以抑制肿瘤侵袭 [54]，我们假设这些淋巴微环境可能形成局部免疫调节网络以遏制肿瘤进展。

为了证实这一假设，我们首先在组织切片上可视化了肿瘤特异性微环境 1 和淋巴相关微环境 3、4 和 12（图 5j）。值得注意的是，这些淋巴相关微环境在浸润性肿瘤微环境的周围显示出一致的富集，形成了可辨别的聚集网络。这种空间模式通过独立重复样本得到进一步证实（图 S9f）。在细胞类型水平上，观察到包括 CD4+、CD8+ T 细胞和 DCs（树突状细胞）在内的免疫细胞群在同一浸润性肿瘤边缘显著富集，这与之前的发现一致（图 5k，图 S9g）。这些结果提供了不同免疫细胞类型在肿瘤边界共定位的初步证据，可能通过微环境相互作用促进局部免疫调节网络的形成。为了进一步阐明这一现象，我们采用了 CellChat V2 [55]，这是一种用于推断整合空间数据的细胞间相互作用的先进工具。跨所有微环境的分析显示，微环境 3 和 12 表现出最小的传入和传出相互作用强度，表明在这些区域内建立了局部相互作用网络（图 5l）。此外，鉴定出 CD80 信号通路是驱动此局部网络的关键调节轴，突出了其在调节免疫 - 肿瘤动态中的潜在作用（图 5m）。为了在功能水平上调查此局部网络的潜在机制，我们对微环境 3 和 12 的差异标记物进行了富集分析（图 5n 和 o）。发现两个微环境均富集于肿瘤相关通路，包括抗原介导的信号通路和细胞介导的免疫。此外，为每个微环境鉴定出不同的信号通路，突显了它们的独特特征。例如，微环境 3 特异性地与细胞对细胞因子刺激的细胞反应相关（图 5n），而微环境 12 与 B 细胞激活及相关过程相关（图 5o）。这些发现表明，虽然微环境 3 和 12 共享核心功能特征，有助于网络协同，但它们也具有微环境特异性属性。共享功能与独特功能之间的这种平衡对于维持网络的功能多样性和适应性至关重要，从而支持其在调节免疫 - 肿瘤相互作用方面的可扩展性和有效性。

讨论 我们的研究结果表明，Garfield 是一种新型且通用的单细胞和空间嵌入算法，为整合单模态和多模态单细胞及空间组学数据提供了稳健的框架。通过利用 VGAE 和自监督、多任务学习方法，Garfield 成功统一了分子和空间信息，实现了对细胞景观和组织特异性微环境的精确表征。这种能力标志着相比现有方法（如 Seurat V4、MultiVI 和 MOFA+）的重大进步，后者依赖更有限（图）结构，且往往难以处理空间和跨模态集成。基准测试结果突显了 Garfield 的科学意义，因为它在各种数据集上始终优于最先进的工具，包括 scRNA + scATAC、scRNA + scADT 和空间多组学。

特别是在空间微环境检测方面，Garfield 在识别细粒度的解剖和功能结构方面表现出色，例如嗅球的外丛状层（IPL）、NSCLC 数据集中的肿瘤特异性微环境以及近端细胞间相互作用网络。Garfield 通过识别肿瘤边缘协调 T 细胞、B 细胞和 DCs 之间局部 CD80 介导相互作用的免疫微环境，揭示了关于乳腺肿瘤微环境的新见解。这些微环境在浸润性肿瘤区域周围形成类似屏障的结构，淋巴微环境富集了细胞因子反应（例如 IFN-γ）和 B 细胞激活通路。空间相互作用分析揭示了跨重复样本的保守 CD80 信号中心，表明存在协调的免疫监视机制。这些发现突显了其在揭示复杂组织环境中异质性方面的用途，以及其跨模态和分辨率集成信息的能力，为生物医学研究中的广泛应用奠定了基础。

Garfield 能够无需重新训练即可将查询数据集映射到参考图谱，这使其成为协作空间图谱计划的平台。其构建大规模空间参考图谱并无缝映射查询数据集的能力，使我们对跨平台和条件的保守空间微环境有了更深入的理解。通过实现单细胞和空间数据的联合分析，Garfield 开辟了探索跨组织和疾病的保守架构原理的途径。向时间多组学或 3D 空间映射的扩展可能进一步阐明动态细胞生态系统。另一个自然的扩展是缺失模态恢复。Garfield 在此未作为专用的插补方法进行评估，因此我们不作定量插补声明。然而，其变分潜在空间和组学重建解码器提供了一个合理的起点：在配对多组学数据中，可以在输入时屏蔽整个模态块，从观察到的模态和图结构推断潜在表示，并解码保留的块以与配对的真值进行比较。严格评估需要模态感知屏蔽、稀疏计数数据下的校准、特征相关性指标和重建误差指标，以及与专门针对不完整或扰动组学的翻译或生成模型进行比较 [30, 56]。因此，我们将缺失模态恢复视为未来的扩展，而不是当前基准的经验性声明。

尽管取得了这些成就，但仍有一些局限性。虽然 Garfield 能高效集成多模态数据并解决批次效应，但其在高度稀疏数据集和极端高维空间中的性能需要进一步优化。在极端稀疏情况下，ApproxSVD 引导的增强和分子或空间图构建都可能变得不太可靠。每个观察值的非零特征很少时，低秩重建 A^=UqSqVq?可能过度平滑弱局部结构，且从稀疏轮廓构建的 k-近邻图可能包含更嘈杂的邻域。实际缓解措施包括特征选择、调整 ApproxSVD 秩 q（补充表 S6）以及评估图构建邻域，但对极稀疏区域的系统研究仍是未来的工作。关于计算资源，所有实验均在单个 NVIDIA A800-SXM4-80GB GPU 上运行。跨数据集规模（从约 7000 到约 700 000 个观察值）的运行时间和峰值内存使用情况报告在补充表 S3 中；小批量邻域采样保持内存有界，并使得能够在单个 GPU 上在大约 2 小时内训练图 4 中完整的约 700 000 观察值的 NSCLC 图谱。此外，依赖参考图谱（如 Allen Brain Atlas）验证微环境检测会在分析以前未表征的组织时引入潜在偏差。未来的努力可以集中在增强 Garfield 独立于现有参考的功能能力，同时提高大规模数据集的计算效率。

展望未来，推进空间和单细胞多组学分析领域需要解决关键挑战，如提高可扩展性、跨技术的通用适用性以及对动态细胞过程的更深见解。总之，Garfield 弥合了单细胞和空间组学之间长期存在的鸿沟，为假设生成和验证提供了统一框架。通过提供对细胞异质性和空间组织的更深见解，它在推进对复杂生物系统的理解和开发精准医学及组织工程中的下一代应用方面具有巨大潜力。

方法

建模架构

数据加载和预处理

Garfield 模型的输入可以包括来自各种组学来源的一个或多个数据集（如单细胞 RNA、ATAC、ADT 或空间数据），其中每一行对应一个细胞，每一列代表一个特征。数据加载后，Garfield 通过去除非信息性基因来处理数据集，从而优化训练过程。首先，默认排除在少于三个细胞中表达的基因和表达少于 100 个特征的细胞。然后，原始计数经过文库大小归一化，随后进行对数转换。对于 ATAC 和 ADT 数据，应用词频 - 逆文档频率（TF-IDF）和居中 Log 比率（CLR）归一化方法。

随后，默认选择前 3000 个高变基因（HVGs），用于通过主成分分析（PCA）进行降维。对于染色质峰数据，默认选择前 10 000 个高变峰（HVPs），采用潜在语义索引（LSI）进行降维。值得注意的是，在多组学数据集中，来自 PCA 或 LSI 的特征被用作编码器模型中的节点属性。这种方法在表示学习中表现出卓越的性能，如前研究 [57] 所述。而在单模态场景下，默认使用原始表达谱作为模型输入。

一般数据集

受 NicheCompass [24] 启发，Garfield 实现了一个通用的"GraphAnnTorchDataset"类，用于处理单细胞或空间组学数据，通过提取节点特征、邻接矩阵和批次标签实现基于图的学习。在此框架中，设 D={xi,ei,wi,yi}i=1Nobs 表示数据集，其中 Nobs 是观察总数。这里，xi∈RNfeat 表示观察 i 的特定组学特征向量，有 N 个特征 Nfeat?，且 ei,j∈R2×Nedge 表示观察 i 与其邻居观察 j 之间的连接性，源自邻接矩阵 A?。边权重 wi,j 指示观察 i 与其邻居观察 j 之间的连接权重，这也从 A?中提取。yi∈R 表示观察 i 的批次标签。特征 xi∈RNfeat 表示从"adata.X"或 adata.obsm["feat"]获得的观察 i 的表达谱，可以包含原始计数或处理后的特征，支持多种数据类型的集成（例如单模态或多模态场景）。

在单模态场景下，我们定义 xi=xi(modj)∈RNmodj?，其中 Nmodj 是来自特定 j 模态的特征数量，且 j 指三种常见模态之一（RNA、ATAC 或 ADT）。在多模态场景下，xi 是处理后基因表达和染色质可及性或蛋白质特征的拼接向量。对于染色质峰，这表示为 xi=xirna‖xiatac 且 xirna∈RrnaN?，和 xiatac∈RatacN?，其中 Nrna 和 Natac 分别是基因和峰区域的数量。对于蛋白质特征，其表达为 xi=xirna‖xiadt 且 xiadt∈RadtN?，其中 Nadt 是抗体的数量。邻接矩阵 A∈RNobs×Nobs 源自"adata.obsp["connectivities"]"。

邻域图构建

考虑一个邻域图 G={vi,si,xi,γi}?，其中每个节点 vi 代表一个观察值，邻接矩阵 si 编码其与单细胞或空间邻居的连接性。从此矩阵，我们可以推导出 vi 与其他观察值之间的边关系及其关联权重。向量 xi 表示节点 vi 的表达向量，而 γi 表示其标签向量。

在 Garfield 算法中，G 是一个无向邻域图，由样本特定的对称 k 近邻子图 Gk 组成，其中 k 是样本数量。G 的构建取决于数据类型。对于单细胞单模态数据，G 是使用 Scanpy [33] 包中的“sc.pp.neighbors”函数计算的。在单细胞多模态场景下，G 由模态内连接（intra_connect）和模态间连接（inter_connect）组成。intra_connect 的计算类似于单细胞单模态的情况。受先前研究 [58] 的启发，不同模态之间的连接被建模为线性分配优化问题，inter_connect 是通过求解该目标函数获得的。我们扩展了原始的细胞匹配方法 [58, 59]，不仅支持 scRNA-seq 和单细胞蛋白质组学，还支持 scRNA-seq 和 scATAC-seq 数据。我们的方法包括在线性分配进行初始匹配之前对 scATAC-seq 数据中的基因活性进行评分，确保峰值特征与 scRNA-seq 数据的特征重叠。此步骤由 Garfield 内置的经 SIMBA [60] 修改的”gene_scores”函数自动执行。因此，最终连接计算为 intra_connect (Eintra) 和 inter_connect (Einter) 的加权和。在数学上，这可以表示为 Asc=w?Einter+(1?w)?Eintra,(1)，其中权重 w 代表 Einter 和 Eintra 对整体连接的相对贡献。

对于空间单模态或多模态数据，Garfield 提供了四种计算空间连接 (Espatial) 的方法：mu_std、radius、KNN 和 Squidpy。mu_std：参考先前的研究 [23]，Garfield 根据细胞的空间坐标计算细胞间的完整成对欧氏距离矩阵。对于每个细胞，识别其 k 近邻，并分析相应的距离。建立连接的边界定义为 boundary=μ+σ，其中 μ 代表到最近邻距离的平均值，σ 代表标准差。如果两个细胞之间的距离在此边界内，则为边分配权重 1；否则，权重为 0。这形式化为 Aij={1,if Distij≤boundary 0,otherwise (2)。Radius：在 Radius 方法中，采用基于半径的邻居搜索。实例化一个具有指定半径参数的“NearestNeighbors”对象，函数识别每个细胞在此半径内的所有邻居。生成的细胞对在图中连接，边权重对应于它们的空间距离。KNN：在 KNN 方法中，使用“kneighbors”函数识别每个细胞的 k 近邻，该函数返回最近邻的距离和索引。然后在每个细胞及其 k 近邻之间建立图边，边权重代表空间距离。Squidpy [34]：Garfield 提供了一种通过 Squidpy 的“spatial_neighbors”函数实现的方法，该方法根据物理接近程度计算空间连接。

此外，基于空间单模态表达谱，我们还使用类似于单细胞数据的“sc.pp.neighbors”函数计算分子连接 (Emolecular)。该函数基于表达数据构建邻域图，其中每个节点代表一个细胞，边由分子谱的相似性确定。对于空间多模态数据，我们通过适配现有的单细胞多组学处理方法，在上述工作流程基础上进行构建。利用我们优化的细胞匹配算法，我们识别空间多模态数据集内的跨模态连接。这些生成的分子连接图捕捉了模态内 (Eintra) 和模态间 (Einter) 关系（如果存在空间多模态数据），提供了分子和空间层面相互作用的详细视图。因此，整体连接计算为空间连接和分子连接权重的总和。在数学上，空间单模态数据的邻接矩阵 Asp 定义为 Asp=(1?w)?Eintra+w?Espatial(3)。对于空间多模态数据，它表示为 Asp=(1?w)?Emolecular+w?Espatial,(4)，其中 Emolecular 定义为 Emolecular=Eintra+Einter(5)。

Garfield 模型 模型概述 为了解决标签信息的稀缺性和任务特定性，我们提出以无监督方式学习嵌入以增强模型的泛化能力。Garfield 首先将所有观测值编码为一个统一图，其中节点代表细胞或空间单元，边捕捉分子或空间关系。然后应用一种强大的表示学习方法 VGAE [31]，包含基于 SVD 的图对比策略、可选的基于 MMD 的转换以及多任务学习设置。此设置包含节点级和边级任务，将观测值嵌入到低维、批次不变生物空间中，非常适合单细胞和空间层面的批次效应校正和多组学整合。该模型建立在编码器 - 解码器框架之上。具体来说，编码器由图编码器模块组成，而解码器包括用于从潜在向量重建邻接矩阵的图解码器模块，以及用于处理组学模态的特征重建解码器模块。这种双模块结构确保潜在表示在整合空间数据的同时捕捉物理图和分子信息。全程，Garfield 以完全自监督方式训练：细胞类型和小生境标签在训练期间从未使用，仅用于对无监督嵌入的事后评估。唯一的内部数据划分是在图边上（通过 edge_val_ratio/node_val_ratio 参数），仅用于 VGAE 的早期停止，因此节点特征和标签既不被划分也不泄露。在查询 - 参考实验中，查询数据集（例如 NSCLC 供体肺 13）完全从图谱构建中留出，仅在此后进行映射，标签通过在学习到的潜在空间中的 kNN 分类器事后转移。

受 LightGCL [39] 框架启发，Garfield 使用 GAT 骨干自动提取局部图依赖关系。SVD 引导增强通过分析全局协作关系增强图对比学习，改善单细胞表示。此外，提供可选的丢边增强策略。符合变分自编码器标准，我们使用标准正态分布作为潜在随机变量的先验，记为 Z～N(0,1)，并应用重参数化技巧，通过反向传播实现端到端训练。

数据增强 对比学习旨在捕捉相似和不相似数据对之间的不变表示。为了创建相似对，我们应用数据增强来生成输入数据的扰动视图。我们提供两种图增强方法：ApproxSVD 引导增强 [39]（默认）和丢边增强 [61]。对于 ApproxSVD 引导增强，我们在原始邻接矩阵 A 上执行稀疏 ApproxSVD，即 A=USV?。这里，U 和 V 是正交矩阵，代表 A 的行 - 行和列 - 列相关矩阵的特征向量，而 S 是奇异值对角矩阵。最大的奇异值通常对应于图的主成分。我们截断奇异值，仅保留前 q 个，并重建邻接矩阵为 A^=UqSqVq?，其中 Uq∈Rm×q 和 Vq∈Rn×q 分别包含 U 和 V 的前 q 列，而 Sq∈Rq×q 是前 q 个奇异值的对角矩阵。重建矩阵 A^ 是 A 的低秩近似，其中 rank(A^)=q。基于 SVD 增强的好处是双重的：它强调主成分，突出关键的细胞 - 细胞相互作用，同时保留细胞对之间的全局协作信号。为了高效处理大型邻接矩阵，我们使用 Halko 等人 [62] 的随机化 SVD 算法，该算法使用低秩正交矩阵近似输入矩阵，然后在较小的矩阵上应用 SVD：U^q,S^q,V^q?=ApproxSVD(A,q),A^SVD=U^qS^qV^q?,(6) 其中 q 是期望的秩，而 U^q∈Rm×q?, S^q∈Rq×q?, 和 V^q∈Rn×q 是近似矩阵。

对于丢边增强（可选），我们基于丢弃率 pdrop 从 E 中随机移除边。具体来说，我们采样一个指示矩阵 Redge_mask∈RN×N 以确定要掩盖哪些边。每个条目 Rij 采样为 Rij～Bernoulli(1?pdrop) if Aij=1, else Rij=0 (7)。然后计算增强的邻接矩阵为 A^=A⊙Redge_mask,(8) 其中 ⊙ 表示哈达玛积。ApproxSVD 引导和丢边增强都生成保留原始图结构的扰动邻接矩阵 A^。为了进一步增强鲁棒性，我们引入一个特征掩码向量 Rfeat_mask∈RN×1（记为 Rfm），其中每个条目 Ri～Bernoulli(1?pdrop)，pdrop 为掩码概率。掩码特征矩阵表示为 X^=Concat(x1⊙Rfm,x2⊙Rfm,…,xN⊙Rfm)(9)。

Garfield 编码器 通过数据预处理以及 ApproxSVD 引导或丢边增强策略，Garfield 可以生成原始视图 G1 以及增强视图 G2；然后我们使用节点级图对比学习来学习细胞嵌入。鉴于 GAT [37] 是图表示学习的最新架构，并且擅长从图结构数据中提取丰富的嵌入，我们将其用作特征提取器来捕捉细胞节点的潜在嵌入。具体来说，在 GAT 中，每个节点通过关注其邻居来更新其表示，使用其自身的表示作为查询。这种方法通过允许节点计算加权平均，优先考虑相关邻居 [63]，扩展了标准的邻居平均或最大池化。对于一组节点特征 h=[h1;h2;…;hN]，其中 hi∈RD，对所有节点应用具有权重矩阵 W 的共享线性变换。然后通过 eij=α(Whi,Whj) 将注意力机制 α 成对应用于变换后的节点特征，这反映了节点 j 对节点 i 的贡献程度。头 n 的注意力系数 αij(n) 计算为 αij(n)=exp?(LeakyReLU(a(n)T[Whi‖Whj]))∑k∈Niexp?(LeakyReLU(a(n)T[Whi‖Whk])),(10) 其中 ‖ 表示拼接，使用 LeakyReLU 是为了在参数为非正时允许小梯度。然后归一化系数与邻居特征（通常在应用非线性 σ 之后）结合以产生输出节点特征。多头注意力，记为 K，可以通过两种方式应用：h~i=‖k=1Kσ(∑j∈NiαijkWkhj),h^i=σ(1K∑k=1K∑j∈NiαijkWkhj)(11)。左侧公式适用于隐藏层，因为它输出维度为 K?D 的拼接表示，而右侧公式对注意力头进行平均，适用于输出层。除了 GAT，我们还提供了 GATv2 [36]，这是一个具有动态注意力机制的改进版本。GATv2 中的注意力系数计算为 αij(n)=exp?(a(n)TLeakyReLU(Whi‖Whj))∑k∈N(i)exp?(a(n)TLeakyReLU(Whi‖Whk))(12)。对于每个节点 i，第 l 层更新的均值由 μi(l)=1Nhead∑n=1Nhead[∑j∈N(i)αij(n)Whj(l?1)],(13) 给出，其中 μi(l) 和 μi(l?1) 分别代表第 l 层和 (l?1) 层的均值，N(i) 指的是节点 i 的邻居。堆叠 L 个图层产生 L 个输出 [μ1,μ2,…,μL]，从中我们计算最终均值和方差为 μ=1L∑l=1Lμl,σ=MLP(μ)(14)。方差通过单层多层感知机 (MLP) 学习：σ=exp?(μW+b)，其中 W∈Rd×d 和 b∈Rd 是可学习参数。为了生成潜在表示 zi，我们使用重参数化技巧从 N(μi,σi2) 采样：zi=μi+σi?ε，其中 ε～N(0,I) 是高斯噪声。尽管标准差计算为均值的确定性函数，而不是由独立的编码器头发出，但近似后验 q(z∣x)=N(μ(x),diag(σ(x)2)) 对于每个输入仍然是对角高斯，因为 σ 是向量的逐元素指数。到 N(0,I) 先验的闭式 Kullback–Leibler (KL) 散度，KL=12∑d(σd2+μd2?1?2log?σd)（公式 33），取决于后验是对角高斯，而不是 μ 和 σ 独立参数化。因此，在此公式下，闭式 KL、重参数化技巧以及相应的证据下界 (ELBO) 项仍然有效。将 σ 与 μ 绑定可产生随编码信号缩放的每个节点的自适应方差。标准 VGAE 编码器模板中存在的单独的对数标准差头不被 Garfield 的训练前向传递或报告的推理嵌入使用；我们澄清了这一实现细节，并在修订代码中弃用了未使用的头以避免歧义。

对于 Garfield Light（模型的低内存版本），我们用图卷积层 [38] 替换图注意力层进行消息传递。此外，为了降低 xi 的维度，可以在图编码器网络之前添加一个隐藏大小为 Nhid 的可选全连接层以降低内存消耗。其节点级公式为 hi=ReLU(Wxi),(15)，其中 W∈RNhid×Nfeat 是可学习权重矩阵（为简洁起见省略偏置项）。

Garfield 解码器 估计潜在变量 Z 的概率分布后，图生成的目标是重建原始图结构和表达谱。为此，Garfield 解码器由图解码器模块和组学解码器模块组成。组学解码器模块进一步分为两个子模块：内积解码器和特征重建解码器。对于图解码器模块，重建的邻接矩阵 A~ 使用成对潜在特征之间的余 cosine 相似度计算，公式为 A~i,j=cosine sim(zi,zj)=zi?zj|zi||zj|(16)。在组学解码器模块中，我们首先使用内积解码器重建图的邻接矩阵。给定节点嵌入 Z∈RN×d，其中 N 是节点数量，d 是嵌入维度，内积解码器通过计算节点嵌入之间的点积来预测边。预测的邻接矩阵 A′~ 表示为 A′~=σ(ZZT),(17)，其中 Z∈RN×d 是嵌入矩阵，每行代表一个节点的嵌入。乘积 ZZT 产生一个 N×N 矩阵，其中每个元素 A′~i,j 代表节点 i 和 j 之间边的预测概率。

激活函数 σ（通常为 Sigmoid）将输出值限制在 [0, 1] 范围内，使其可解释为边概率。第二个子模块，特征重构解码器，旨在从嵌入 Z 重构组学表达矩阵 X~。在本实验中，该解码器重构用于训练的观察特征矩阵。因此，本研究未将 Garfield 作为缺失模态插补模型进行训练或评估。恢复完全屏蔽的模态需要特定模态的屏蔽或输出头，以及与配对真实值对照的独立验证协议。给定两个节点 i 和 j 及其嵌入 hi 和 hj，它们之间的注意力系数计算为 eij=LeakyReLU(a?[Whi‖Whj]),(18)，其中 a 是可学习的注意力向量，W 是权重矩阵，‖ 表示拼接。归一化的注意力系数随后使用 softmax 函数计算：αij=exp?(eij)∑k∈N(i)exp?(eik)(19) 节点嵌入更新为其邻居嵌入的加权和：hi′=σ(∑j∈N(i)αijWhj),(20)，其中 σ 是激活函数（例如 ReLU），N(i) 是 i 的邻居节点集合。如果使用边权重 w，它们会在消息传递期间缩放节点特征：hi′=σ(∑j∈N(i)αij?wijWhj),(21)，其中 wij 是节点 i 和 j 之间的边权重。通过堆叠多个 GAT 层并应用基于注意力的消息传递，解码器从编码期间学习的潜在表示中重构节点特征。

Garfield 数据加载器 为了将 Garfield 扩展到大型数据集，其中邻域图 G 可能变得计算密集，我们使用带有归纳邻居采样 [63] 的小批量训练。与将整个图加载到内存中的方法 [20, 64, 65] 不同，后者对于大型数据集是不可行的，我们在训练期间从 G 的 k 近邻中采样固定数量的邻居 nsam=3 进行消息传递。这里，nsam 控制用于小批量消息传递的采样邻居数量，与图构建邻居计数 k 不同。对 nsam∈{1,3,5,10,15} 的单一种子敏感性分析（补充表 S5）显示，在测试的数据集中，性能在默认值附近保持稳定，而较大的值会增加内存和运行时间，而没有一致的收益。类似于 NicheCompass [24]，我们采用两个独立的特定任务数据加载器：用于节点级任务的节点级加载器和用于边级任务的边级加载器。每次模型迭代包括通过每个加载器的前向传播和联合反向传播，以同时计算梯度。节点级加载器负责组学预测任务，例如重构 X~ 和邻接矩阵 A~。边级加载器仅用于重构 A~。

损失函数 Garfield 损失函数由边级和节点级损失组成，因为存在边级和节点级任务。边级损失利用加权二元交叉熵（BCE）来重构邻接矩阵 A~ 中的边，而节点级损失由几个部分组成：用于特征重构 X~ 的均方误差（MSE）、用于潜在向量的对比损失、潜在变量的变分后验与标准正态先验之间的 KL 散度，以及用于组学数据的批次效应对齐损失（当存在多个批次时）。此外，为了确保模型在节点级任务中捕捉边相关信息，还应用了带有负采样的 BCE 损失。其中，图重构损失（BCE）和 KL 散度损失联合称为 ELBO。

对于边级损失，Garfield 首先使用加权 BCE 方法计算边重构，以确保数值稳定性。正权重 Wpos 由负边与正边的比率决定：Wpos=EnegEpos=∑(Erecon==0)∑(Erecon==1)(22) 这种加权防止了对负样本的偏差。用于边重构的小批量 BCE 损失由下式给出 L(edge)=?1|Erecon|∑(i,j)∈Erecon[ωposAi,jlog?(σ(A~i,j))+(1?Ai,j)log?(1?σ(A~i,j))],(23)，其中 A~ 是边重构 logits 矩阵，σ(x)=11+e?x 是应用于 logits 的 Sigmoid 函数。

Garfield 使用自监督损失学习重构的表达谱，该损失结合了来自潜在嵌入（Z）的 MSE 与组学损失函数：L(omics)=1N∑i=1N‖xi?x~i‖2,(24)，其中 xi 和 x~i 分别表示原始和重构的表达谱，N 是细胞的总数，‖?‖2 表示 L2 范数（欧几里得距离），用于衡量原始和重构谱之间差异的大小。

对于节点级任务的对比学习 [66, 67]，潜在嵌入 Z1（来自原始视图）和 Z2（来自增强视图）使用权重共享投影头 gI(?) 投影到公共潜在空间，该投影头实现为两层 MLP。给定大小为 N 的小批量，Garfield 通过增强（如基于 SVD 的或边丢弃策略）生成 2N 个样本 {x1m,x2m,…,xNm,x1n,x2n,…,xNn}，形成原始和增强样本对 {xim,xin}。样本对之间的相似度使用余 cosine 距离计算：sim(zik1,zjk2)=(zik1)(zjk2)?‖zik1‖‖zjk2‖,k1,k2∈{m,n},i,j∈[1,N](25) 样本 xim 的对比损失由下式给出 ?im=?log?exp?(sim(zim,zin)/τins)Dim,Dim=exp?(sim(zim,zin)/τins)+∑j≠iNexp?(sim(zim,zjm)/τins)+∑j≠iNexp?(sim(zim,zjn)/τins),(26)，其中 τins 是实例级相似度的温度参数。整体实例级对比损失 [68] 计算为 L(ins)=12N∑i=1N(?im+?in)(27) 通过最小化此损失，正样本对被拉近，负样本对被推开，从而保留生物学变异性并隐式校正批次效应 [65]。公式 27 中的实例级目标是 InfoNCE 估计量 [68]。每一项 ?im 是在 2N?1 个批内候选者中识别匹配增强视图的交叉熵；因此，L(ins)=?INCE(z1;z2)+log?(2N?1)，最小化它最大化原始视图和 ApproxSVD 去噪视图之间的变分下界 INCE(z1;z2)≤I(z1;z2)。这个界是一个变分代理，而不是无偏 MI 估计。经验上（补充图 S10），优化该目标提高了对比损失作用的投影空间中的界，而打乱的正样本对控制使其崩溃。然而，当在编码器潜变量上测量时，即使没有对比项，这两个视图也已经具有很强的相互信息量，表明在这些数据上，对比损失主要是正则化，而不是单纯创建视图一致的表示。

除了实例级损失外，Garfield 还采用聚类级对比损失 [69]，该损失在表示学习中已显示出稳健的性能。使用两层 MLP gC(?)，特征矩阵被投影到 M 维空间（其中 M 是聚类数量）。聚类对之间的相似度也使用余弦距离测量：sim(y^ik1,y^jk2)=(y^ik1)?(y^jk2)‖y^ik1‖‖y^jk2‖,k1,k2∈{a,b},i,j∈[1,M](28) 给定聚类 y^ia 的聚类级损失公式为 ?^ia=?log?exp?(sim(y^ia,y^ib)/τclu)∑j=1M[exp?(sim(y^ia,y^ja)/τclu)+exp?(sim(y^ia,y^jb)/τclu)],(29)，其中 τclu 是聚类级相似度的温度参数。整体聚类级对比损失为 L(clu)=12M∑i=1M(?^ia+?^ib)?H(Y),(30)，聚类分配概率的熵 H(Y) 定义为 H(Y)=?∑i=1M[P(y^ia)log?P(y^ia)+P(y^ib)log?P(y^ib)](31) 小批量下每种增强的概率 P(y^ik) 计算为 P(y^ik)=∑t=1NYtik‖Yk‖1,k∈{a,b},(32)，其中 Ya∈RN×M 表示 gC(?) 在原始视图下的小批量输出，Yb 表示增强视图下的相应输出。这个项 H(Y) 有助于避免平凡解，确保平衡的聚类分配 [70]。

小批量 KL 散度 [24] 由两部分组成：涉及节点批次中节点的节点级 KL 散度，以及包括边批次中正负边对中节点的边级 KL 散度：L(KL)=1NVbat∑i∈VbatLi(KL)(μi,σi;xi)+14NEbat∑(i,j)∈Ebat(Li(KL)(μi,σi;xi)+Lj(KL)(μj,σj;xj))(33) 这里，变分参数 μi 表示近似后验正态分布的估计均值，作为图编码器模块的输出获得，σi 表示基于 μi 通过一层 MLP 投影获得的估计标准差。NVbat 表示节点批次 Vbat 中的节点数，而 NEbat 表示边批次 Ebat 中的边数。

此外，在节点级任务中应用了类似的边重构损失 L′edge，使用带有负采样的 BCE，其中 y^pos 表示正（真实）边的解码器输出，y^neg 表示负（随机采样）边的输出，E 是边的总数：L′(edge)=?1E(∑ilog?(y^ipos)+∑jlog?(1?y^jneg))(34) 如果输入数据包含多个批次，Garfield 采用 MMD [40] 损失来对齐不同批次之间的数据。受 scArches [32] 启发，Garfield 使用 MMD 匹配潜在分布 q?(Z∣s=i) 和 q?(Z∣s=j)，其中 s 表示批次键。MMD 损失公式如下：L(mmd)=?mmd(ZS=i,Z′S=j),(35)，其中 ?mmd(X,X′)=1n02∑n=1n0∑m=1n0k(xn,xm)+1n12∑n=1n1∑m=1n1k(xn′,xm′)?2n0n1∑n=1n0∑m=1n1k(xn,xm′)(36) 这里，X 和 X′ 分别是在条件 Si 和 Sj 下的高维观测。

Garfield 模型在模型训练期间优化的总损失函数因此为 L(total)Batch= L(KL)+λ1(edge)L(edge)+λ2(omics)L(omics)+λ3(edge)L′(edge)(37) +λ4(ins)L(ins)+λ5(clu)L(clu)+λ6(mmd)L(mmd)(37) 如果没有批次信息，总损失如下：L(total)NoBatch= L(KL)+λ1(edge)L(edge)+λ2(omics)L(omics)+λ3(edge)L′(edge)+λ4(ins)L(ins)+λ5(clu)L(clu),(38)，其中总损失组件的权重因子表示为 λ。损失权重是在任务机制级别选择的，以平衡相应项的有效幅度，而不是通过特定组织的网格搜索。这些有效幅度取决于输入维度、图密度、小批量节点/边采样和固定的实现级损失归一化因子。因此，配对多组学、空间和多样本分析使用机制适当的设置，而每种机制内的消融和敏感性实验仅改变目标模块或权重。因为重构损失使用均值归约进行评估，实现会在应用 λ 之前重新缩放它们：特征重构 MSE 乘以特征缩放因子以近似与 KL 项相当的特征求和尺度，潜在邻接和边重构项乘以固定的图缩放因子。这些确定性常数被吸收到有效的 λ 中。模块消融（补充表 S4，两种种子）和对单个损失权重（补充表 S7，单种子）、nsam（补充表 5，单种子）、ApproxSVD 秩 q（补充表 S6，单种子）以及 MMD 批次对齐（补充表 S8，单种子）的敏感性分析支持所选任务级设置周围的局部鲁棒性。

基准测试 所有基准测试实验都是完全可复现的，可以通过 https://github.com/zhou-1314/Garfield-reproducibility 提供的笔记本访问。这些实验在一台配备 NVIDIA A800-SXM4-80GB GPU 的高性能计算基础设施上进行，确保稳健和高效的执行。

数据集概述 本手稿中展示的数据集大致可分为两类：单细胞多组学数据集和空间组学数据集。除非另有说明，细胞类型注释和元数据直接来源于原始出版物。

单细胞多组学数据集 我们从近期的一项基准测试研究 [71] 中收集了主要的单细胞多组学测序数据集，包括五个单细胞 RNA + 蛋白质数据集和九个单细胞 RNA + ATAC 数据集。这些数据集是使用多种测序技术生成的，包括 CITE-seq [1]、SHARE-seq [4]、SNARE-seq [3]、ISSAAC-seq [5] 和 10x Multiome (https://www.10xgenomics.com/products/)。为了确保数据质量，我们采用了 Seurat V4 的质量控制过滤器，参数如原始出版物中所述，有效地过滤掉了低质量细胞、scRNA-seq 数据中的 RNAs 和 scATAC-seq 数据中的峰值。更多细节见补充表 S1 以及“数据可用性”部分。

空间数据集

Slide-seqV2 小鼠海马体
SlideSeqV2 数据集 [6] 代表小鼠海马体，是使用 Squidpy(v1.6.1) 的 datasets.slideseqv2() 函数检索的。该数据集包含一个海马体小块，具有 41 786 个近细胞分辨率的观测值和 4000 个基因。由于数据集经过了对数转换计数的预处理，我们进行了反向对数归一化，以推导与 Garfield 兼容所需的原始计数。为了促进基准测试，我们参考了 Allen Brain Atlas 提供的组织注释，并手动注释数据集以生成实验的真实值。

小鼠嗅球数据集
我们收集了两个 MOB 数据集，分别使用 Stereo-seq 和 Slide-seqV2 测序。Slide-seqV2 数据集包含 20 139 个近细胞分辨率的观测值和 21 220 个基因，而来自 Stereo-seq 的亚细胞 MOB 数据集包含 19 109 个观测值和 27 106 个基因。随后将这两个数据集合并为一个 AnnData 对象，包含 39 248 个观测值和 18 279 个基因。模型训练期间将校正不同测序平台引起的批次效应，以确保数据对齐。

高分辨率 Xenium 人类乳腺癌
10x Xenium 人类乳腺癌数据集及其相关元数据来自 10x Genomics (https://www.10xgenomics.com/products/xenium-in-situ/preview-dataset-human-breast)。该数据集包含两个重复样本共 282 363 个细胞：重复 1 中有 164 000 个细胞，重复 2 中有 118 363 个细胞，探测了 313 个基因。为了确保数据质量，我们过滤掉了所有基因总计数少于 10 个或仅在少于三个不同基因中有非零计数的细胞。

NanoString CosMx 人类非小细胞肺癌
NSCLC 的 NanoString CosMx 数据集 [13] 来源自 https://nanostring.com/products/cosmx-spatial-molecular-imager/ffpe-dataset/nsclc-ffpe-dataset/。它涵盖来自五个供体的八个组织切片，共 800 327 个细胞分布如下：供体 1(lung5) 的重复 1、重复 2 和重复 3 分别为 93 206、97 487 和 91 691 个细胞；来自供体 2(lung6) 的 83 723 个细胞；供体 3(lung9) 的重复 1 和重复 2 分别为 77 391 和 115 676 个细胞；来自供体 4(lung12) 的 66 489 个细胞；以及来自供体 5(lung13) 的 76 536 个细胞。在这些数据集中，除了供体 5 (lung13) 外，所有数据集均用于构建详细的空间转录组图谱，提供对 NSCLC 的全面表示。相反，供体 5 (lung13) 被保留为查询数据，以评估 Garfield 无缝和快速集成新获取数据集的能力，突出其适应性和鲁棒性。为确保数据质量，排除了总计数少于 50 个的细胞，产生了 766 313 个高质量细胞。

在模型训练期间，我们通过纳入样本身份和供体来源等协变量来考虑变异性。

空间 ATAC-RNA 多模态小鼠大脑
小鼠大脑的空间表观基因组 - 转录组测序数据集来自 Zhang 等人 [72]。该数据集包含来自一只幼鼠（P22）的脑组织样本，在斑点级分辨率下包含 9215 个观测值，涉及 22 914 个基因和 121 068 个峰。为确保数据质量，我们过滤掉了在少于 46 个细胞（占所有细胞的 0.05%）中检测到计数的基因和峰。随后，我们选择了 Scanpy 识别出的 3000 个最高变基因和 10 000 个最高变峰。最后，两个模态特定的 AnnData 对象被整合为一个单一的多模态 mdata 对象，作为 Garfield 分析的输入。

实验设置和基准方法
单细胞多模态集成任务的基准测试
在单细胞多模态集成任务中，我们系统地比较了 Garfield 与四种针对 RNA 和 ATAC 集成优化的算法以及另外四种针对 RNA 和 ADT 集成设计的算法的性能。这项基准研究涵盖了六种最先进的集成算法。与 SeuratV4 和 Multigrate 类似，Garfield 展示了通用性，能够集成不同的多模态数据集（RNA + ATAC 或 RNA + ADT）。这些算法的参数配置基于以下指南确定：

Garfield。最终联合嵌入是通过基于特定单细胞多模态数据集进行最小参数调整获得的。对于 RNA+ATAC 数据集，"sub_data_type" 参数设置为 RNA+ATAC，基因组参数根据数据集的物种来源配置为人或小鼠。对于 RNA+ADT 数据集，仅将 "sub_data_type" 参数修改为 RNA+ADT。在本基准测试中的配对单细胞集成数据集中，所有其他参数（包括损失权重）均保持默认值，以确保该任务家族内配置一致；在不同任务模式（配对多组学、空间和多批次）下如何设置损失权重已在上方关于公式 37 的描述中说明。具体示例可通过 https://garfield-bio.readthedocs.io/en/latest/tutorial/03.10x_pbmc_paired_scMulti_analysis.html 找到。

SeuratV4。为执行单细胞多模态垂直集成，我们遵循了 Seurat(v4.1.0) 网站上提供的教程，网址为 https://satijalab.org/seurat/articles/weighted_nearest_neighbor_analysis。

MultiVI。使用 MultiVI(scvi-tools v1.2.0) 进行垂直集成的操作遵循了 https://docs.scvi-tools.org/en/stable/tutorials/notebooks/multimodal/MultiVI_tutorial.html 中提供的说明。

MOFA+。我们遵循 MOFA 网站 (v1.9.2) 上概述的指南，网址为 https://muon-tutorials.readthedocs.io/en/latest/single-cellrna-atac/pbmc10k/3-Multimodal-Omics-Data-Integration.html，集成了单细胞 RNA 表达和染色质可及性数据。

totalVI。我们基于 https://docs.scvi-tools.org/en/stable/tutorials/notebooks/multimodal/cite_scrna_integration_w_totalVI.html 中的说明进行分析。分析的关键参数设置为 latent_distribution = normal 和 n_layers_decoder = 2。

scArches。我们遵循了 scArches(v0.6.1) 网站上提供的 RNA+ADT 集成指南：https://scarches.readthedocs.io/en/latest/totalvi_surgery_pipeline.html。模型使用参数 "epochs = 200, plan_kwargs = dict." 进行训练。

Multigrate。使用原始 Multigrate 模型 (v0.0.2) 执行了单细胞多组学数据集成，如 https://multigrate.readthedocs.io/en/latest/notebooks/paired_integration_cite-seq.html 中所述。具体而言，我们对 RNA 数据采用了 "nb" 损失函数，对 ATAC 和 ADT 数据采用了 "mse" 函数。

空间生态位发现任务的基准测试
我们将 Garfield(v1.0.0) 与其他三种空间转录组算法进行了比较：NicheCompass (v0.2.1)、CellCharter (v0.3.2) 和 GraphST (v1.1.1)。对于这项基准研究，我们选择了具有明确组织结构特征的小鼠海马数据作为数据源。我们对该数据集上的每种方法进行了八次训练运行，同时改变邻居的数量。邻居数量范围从 4 到 16，以 4 为步长递增，每种配置在两次独立运行中进行评估。具体来说，这些竞争算法的参数配置设置如下：

Garfield。Garfield 模型使用 Adam 优化器进行训练，初始学习率为 0.001。采用学习率调度器，在没有改进的情况下经过四个 epoch 后将学习率降低 0.1 倍，同时应用了早停法，耐心值为八个 epoch。选择 "GAT" 网络作为 Garfield 编码器，并将 augment_type 设置为 "dropout" 以进行训练和生成细胞嵌入，所有其他参数保持默认设置。详细的训练配置和程序可在 https://garfield-bio.readthedocs.io/en/latest/tutorial/05.Garfield_spatial_niche_slideseqv2_mouse_hippocampus.html 中找到。

NicheCompass。我们遵循了 https://nichecompass.readthedocs.io/en/latest/tutorials/notebooks/mouse_cns_single_sample.html 中提供的模型训练指南，使用默认超参数。

CellCharter。如 https://cellcharter.readthedocs.io/en/latest/notebooks/codex_mouse_spleen.html 中所述，我们利用 scVI (v1.2.1) 进行降维和数据集成。然后使用默认超参数应用 CellCharter(v0.3.2) 以提取潜在表示。

GraphST。我们遵循了 https://deepst-tutorials.readthedocs.io/en/latest 进行模型训练，采用了为 GraphST(v1.1.1) 提供的默认超参数。

基准指标
单细胞集成任务
为了全面基准测试单细胞多组学集成，我们采用 ARI [73]、NMI [74]、cASW [75] 和 cLISI [76] 作为关键指标。ARI 和 NMI 用作主要度量，以评估已知细胞类型标签与 Leiden 算法识别的簇之间的一致性。为确保算法间的公平比较，我们根据原始细胞类型的数量自动为每种算法确定适当的分辨率，确保簇的数量一致。

ASW 指标评估了每种集成算法计算出的细胞间距离的精度。具体而言，我们使用基于细胞类型标签的 ASW (cASW) 来评估每种算法保留生物学变异的能力。较高的 cASW 表明细胞类型分离更好，反映了在簇内分组细胞的准确性提高（簇内相似性），同时保持与其他簇的区别性（簇间相异性）。

我们还利用 LISI 评估细胞类型分离，在本研究中将其标记为 cLISI。较低的 cLISI 值表明细胞类型分离更有效，生物学变异保留更多。为确保结果解释的一致性，我们应用了线性变换 [77]，使得较高的 cLISI 值代表性能提升。

最后，我们引入了生物学变异保留分数，这是评估集成算法的总指标。该分数计算为 ARI、NMI、cASW 和 cLISI 的平均值，提供了每种算法跨数据集保留生物学变异能力的综合度量。

空间集成任务
为了全面基准测试空间数据集成，我们采用 ARI [73]、NMI [74]、AMI、HOM [78]、ASW [75] 作为关键指标。这些指标使用 scikit-learn [79] 或 scIB [77] 包计算。为了减轻 Leiden 算法中分辨率参数引入的潜在偏差，我们使用每种算法的潜在嵌入，在从 0.1 到 2.0（以 0.1 为增量）的分辨率范围内执行了 Leiden 聚类。然后根据在这些分辨率下达到的最高 ARI 和 NMI 值评估每种算法的性能。

调整兰德指数 (ARI)
ARI 通过比较成对分组来量化聚类结果与真实标签之间的一致性。设 C 表示真实标签，K 表示预测标签。定义：m：在 C 和 K 中都分配到同一组的样本对数量。n：在 C 和 K 中都分配到不同组的样本对数量。未调整兰德指数 (RI) 的计算公式为 RI=(m+n)/(nsamples2)，其中 (nsamples2) 表示可能的样本对总数。由于 RI 对随机标签分配敏感，特别是在簇和样本数量相似时，ARI 通过纳入期望值 E[RI] 来调整偶然一致性。调整后的公式为 ARI=(RI?E[RI])/(max(RI)?E[RI])。这种调整确保随机聚类的 ARI 分数接近于零，为评估聚类性能提供了稳健且标准化的度量。

归一化互信息
NMI 是一项旨在量化预测标签与真实标签之间对齐程度的指标。给定代表相同 N 个对象的两个标签集 U 和 V，每个集的熵反映了与其分区相关的 Uncertainty。U 的熵可以表示为 H(U)=?∑i=1|U|P(i)log(P(i))，其中 P(i) 表示从 U 中随机选择一个属于分区 Ui 的对象的概率，计算为 P(i)=|Ui|/N。类似地，V 的熵计算为 H(V)=?∑j=1|V|P′(j)log(P′(j))，其中 P′(j) 表示对象被分配到分区 Vj 的概率，定义为 P′(j)=|Vj|/N。为了衡量 U 和 V 之间的共享信息，MI 定义为 MI(U,V)=∑i=1|U|∑j=1|V|P(i,j)log(P(i,j)/(P(i)P′(j)))，其中 P(i,j) 是对象同时属于 U 中的分区 Ui 和 V 中的 Vj 的联合概率，表示为 P(i,j)=|Ui∩Vj|/N。NMI 通过用 U 和 V 的平均熵除以 MI 来提供尺度不变的比较，如下所示：NMI(U,V)=MI(U,V)/mean(H(U),H(V))。这种标准化确保分数保持在一个一致的范围内，便于在不同数据集或聚类算法之间进行比较。

调整互信息
AMI 通过考虑因偶然性导致的两个标签分配之间的期望相似性来优化 MI。其定义为 AMI=(MI?E[MI])/(mean(H(U),H(V))?E[MI])，其中 E[MI] 表示随机标签下 MI 的期望值。期望 MI，E[MI(U,V)]，计算如下：E[MI(U,V)]=∑i=1|U|∑j=1|V|∑nij=(ai+bj?N)+min(ai,bj)nijNlog(N?nijaibj)?ai!?bj!?(N?ai)!?(N?bj)!N!?nij!?(ai?nij)!?(bj?nij)!?(N?ai?bj+nij)!，其中 ai=|Ui| 和 bj=|Vj| 分别表示分区 Ui 和 Vj 中的元素数量，N 是对象的总数。这里，nij 表示 U 中的分区 Ui 和 V 中的 Vj 之间的共享元素数量。项 (ai+bj?N)+ 确保求和的非负下界。通过调整 E[MI]，AMI 消除了由偶然性引起的偏差，确保对聚类结果进行稳健且标准化的比较。

同质性 (HOM)
同质性是一种聚类评估指标，用于评估每个簇是否仅由来自单个类别的成员组成。该指标背后的原理是，定义良好的簇应仅包含彼此相似的数据点。同质性分数范围为 0 到 1，其中：得分为 1 表示完全同质，意味着每个簇仅包含来自一个类别的成员。得分为 0 表示完全异质，簇由来自多个类别的成员组成。该指标提供了聚类算法在簇内保留类别完整性的有效程度的度量。

平均轮廓宽度
ASW 指标评估了每种集成算法计算出的细胞间距离的精度。在我们的研究中，采用基于生态位标签的 ASW 来评估每种算法保留生态位特异性生物学变异的有效性。

下游分析
数据可视化
为了可视化各种方法生成的潜在表示，我们采用 UMAP 算法将潜在矩阵降维至二维。首先使用 Scanpy 的 pp.neighbors() 函数（采用默认配置）构建 k 近邻图，然后通过 tl.umap() 进行降维。随后通过 scanpy.pl.umap() 绘制生成的二维嵌入。对于空间坐标可视化，我们使用了 Scanpy(v1.9.1) 包内的 scanpy.pl.embedding() 函数。

生态位识别
通过 scanpy.tl.leiden() 函数在模型的潜在空间上进行 Leiden 聚类，将每个簇定义为一个生态位。通过层次聚类分析生态位之间的关系，使用 scanpy.tl.dendrogram()，以生态位标签作为输入，并应用 "ward" 或 "single" 链接方法。

邻域组成分析
邻域组成分数评估了已识别生态位与细胞类型之间的空间接近度。我们利用 Garfield 包中的内置 calc_neighbor_prop 函数来计算该分数。具体而言，Garfield 首先使用空间坐标计算每个细胞的最近邻居，识别邻域内的细胞类型，并计算每种细胞类型在邻居中的比例。

空间 CHAOS 分数计算
为了评估 Garfield 识别出的生态位的空间连续性和紧凑性，我们计算了空间 CHAOS 分数 [52]。对于每个切片 s，为每个生态位 m 内的所有空间位置构建了一个最近邻居 (1NN) 图。位置 i 和 j 之间的边权重定义为 Eij={eij, 如果 i 和 j 是 1NN; 0, 否则}。这里，eij 表示 i 和 j 之间的欧几里得距离。切片 s 的空间 CHAOS 分数计算为 CHAOS=∑m=1M∑i,j∈mEij/Ns，其中 Ns 是切片 s 中空间位置的总数，M 是空间生态位的总数，i,j∈m 表示 i 和 j 属于生态位 m。

细胞类型的富集分数计算
为了评估特定细胞类型在生态位内的富集情况，我们采用了一种“富集比率”指标。该比率比较了给定类型细胞的观察数量与期望数量，假设该细胞类型在所有生态位中均匀分布。生态位内的期望细胞数量使用卡方检验计算。富集比率超过 1 且 P 值低于 0.05 表明该细胞类型在生态位中显著富集。

邻近细胞 - 细胞共定位网络构建
为了构建邻近细胞 - 细胞相互作用网络，使用 squidpy.gr.spatial_neighbors() 函数创建了空间连接图，并通过 Squidpy(v1.6.1) 包中的 squidpy.gr.interaction_matrix() 函数计算相互作用矩阵。细胞类型 i 和 j 之间的相互作用强度 Cij 计算为 Cij=Cji=(Xij+Xji)/2，其中 Xij 和 Xji 是细胞类型 i 和 j 之间的细胞 - 细胞相互作用强度。为了检验统计显著性，通过打乱细胞类型标签同时保持空间连接图不变，进行了基于置换的检验（默认 n=1000）。P 值确定为置换后的相互作用强度超过真实相互作用强度的比例。

细胞数量少于 10 个的细胞类型被排除在分析之外。差异表达基因分析 获得生态位标签后，使用 Garfield 包内置的 calc_niches_marker 函数对已识别的生态位进行差异表达基因 (DEG) 分析，以鉴定 DEGs。功能富集分析 通过差异表达基因分析获得 DEGs 后，使用 Garfield 包内置的 calc_niches_enrich 函数进行功能富集分析，以探索每个生态位的功能术语。细胞 - 细胞相互作用分析 采用 CellChat V2 [55](v2.1.0) 来推断、分析和可视化空间 Xenium 人乳腺癌 (BC) 数据中生态位之间的细胞间通讯。配体 - 受体相互作用是使用"Scanpy"标准化表达矩阵进行分析的，相互作用对来源于 CellChatDB，这是一个经过整理的小鼠和人配体 - 受体相互作用数据库。鉴定了每个生态位过表达的配体和受体，并通过评估与每个信号通路相关的所有配体 - 受体相互作用来推断通讯概率。

关键点 Garfield 提供了一个基于图的统一对比学习框架，用于整合跨转录组、表观基因组和蛋白质组模态的单细胞和空间多组学数据。Garfield 保留了分子特异性和空间拓扑结构，能够实现稳健的细胞嵌入、批次校正、空间生态位发现和查询到参考的映射。跨单细胞多组学和空间组学数据集的基准测试表明，Garfield 的表现可媲美或优于最先进的集成和生态位检测方法。Garfield 实现了跨平台的空间生态位转移，支持跨测序技术构建和查询空间参考图谱。在非小细胞肺癌和乳腺癌中的应用揭示了异质性的肿瘤微环境生态位和空间组织化的免疫相互作用程序。

致谢 感谢 X.F. 和其他作者对改进 Garfield 的协助，以及 X.L. 对手稿的评论。我们感谢广州实验室数据科学平台和生物医学大数据操作系统 (Bio-OS) 的支持。

作者贡献 概念化：Weige Zhou, Wenfei Jin 和 Luyi Tian；方法论：Weige Zhou；软件：Weige Zhou；形式分析：Weige Zhou, Xueying Fan, Lanxiang Li 和 Jianrong Zheng；可视化：Weige Zhou；写作—初稿：Weige Zhou 和 Luyi Tian；写作—审阅和编辑：Xiaodong Liu 和 Wenfei Jin；监督：Weige Zhou, Wenfei Jin 和 Luyi Tian。所有作者阅读并批准了最终手稿。

利益冲突 作者声明没有竞争利益。

资金 这项工作得到了广州实验室重大项目的支持 (资助号：GZNL2024A03001)。

数据可用性 本研究中分析的数据集均来自公开可用数据集 (补充表 1)。具体来说，对于单细胞多组学数据集，它们是从最近的一项基准测试研究 [71] 中获得的，包括五个单细胞 RNA + 蛋白质数据集和九个单细胞 RNA + ATAC 数据集。对于空间测序数据集，代表小鼠海马体的 SlideSeqV2 数据集是使用 Squidpy 中的 datasets.slideseqv2() 函数检索的。由 Stereoseq 和 Slide-seqV2 平台生成的小鼠嗅球组织数据可分别通过 https://github.com/JinmiaoChenLab/SEDR_analyses 和 https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP815 获取。10x Xenium 人乳腺癌数据集及其相关元数据是从 10x Genomics 获得的 (https://www.10xgenomics.com/products/xenium-in-situ/preview-dataset-human-breast)。用于 NSCLC 的 NanoString CosMx 数据集来源于 https://nanostring.com/products/cosmx-spatial-molecular-imager/ffpe-dataset/nsclc-ffpe-dataset/。空间表观基因组 - 转录组测序小鼠脑数据集是从 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE205055 (基因表达计数和空间坐标) 和 https://brain-spatial-omics.cells.ucsc.edu/ (峰计数和细胞类型标签) 检索到的。所有使用数据集的详细信息可在方法部分找到。Allen 小鼠大脑图谱的注释图像可通过 https://mouse.brain-map.org/static/atlas 获取。Garfield 可作为 Python 包使用，维护于 https://github.com/zhou-1314/Garfield。用于重现我们分析和基准测试结果的 Jupyter 笔记本可在 https://github.com/zhou-1314/Garfield-reproducibility 获取。文档提供于 https://garfield-bio.readthedocs.io/。

参考文献