《Journal of Insect Behavior》：Age-Related Behavioral Changes Across the Adult Lifespan of a Cricket: A Longitudinal Analysis Using DeepLabCut
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昆虫衰老的特征是渐进性的行为变化，包括运动能力衰退、睡眠改变以及昼夜节律紊乱。双斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus）因其实验上易于处理的成年寿命、明确的行为谱以及便于实验室饲养，成为行为衰老研究的有用模型。然而，同时追踪整个成年寿命中多种行为的研究
昆虫衰老的特征是渐进性的行为变化，包括运动能力衰退、睡眠改变以及昼夜节律紊乱。双斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus）因其实验上易于处理的成年寿命、明确的行为谱以及便于实验室饲养，成为行为衰老研究的有用模型。然而，同时追踪整个成年寿命中多种行为的研究仍然有限。本研究采用连续行为记录与基于DeepLabCut的无标记姿态估计，量化了在12:12小时光暗周期下饲养的8只成年雄性双斑蟋蟀中与年龄相关的行为变化。行为被分类为运动（locomotion）、静息（resting）、类睡眠状态（sleep-like state, SLS）、取食（feeding）、饮水（drinking）和鸣叫（calling），并增设“其他（others）”类别。研究人员将每只个体的记录划分为三个寿命归一化阶段——早、中、晚期，评估了光相与暗相中每小时及总活动的年龄相关变化。运动、静息和SLS在光暗相之间存在显著差异且随年龄变化。总移动距离随寿命区段的变化呈时间依赖性。雄性鸣叫表现出显著的光暗差异与年龄相关偏移，而取食和饮水未检测到差异。相关性分析揭示鸣叫减少与SLS增加相关，但与运动变化无关，表明生殖通讯衰退可能并非单纯反映全身性运动衰退。这些发现表明成年蟋蟀的行为衰老是行为特异性的而非一致性衰退，为在蟋蟀及其他非传统昆虫模型中研究行为衰老提供了框架。
研究背景方面，衰老被定义为生理与行为功能随时间的渐进性衰退。昆虫因寿命相对短、生活史多样且适合纵向行为分析，成为研究衰老的有用系统，其中黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）揭示了运动与学习能力下降、睡眠片段化及昼夜节律失稳等年龄相关变化。然而多数现有衰老研究聚焦单一行为及其内因，同时追踪多种行为跨整个成年寿命的分析十分稀少，非果蝇昆虫（如蜜蜂、蟋蟀）的长期多行为数据不足，行为衰老的跨物种规律尚未明晰。双斑蟋蟀具备体大利于姿态追踪、行为谱丰富（声信号、运动、静息）、成年寿命约1至2个月、基因组资源扩展及昼夜节律神经科学基础扎实等优势，但此前无研究明确刻画其成年全寿命的多行为变化。为此，研究人员开展本研究，旨在用自动化姿态估计结合连续录像，定量描述雄性双斑蟋蟀成年全期六种行为状态（运动、静息、类睡眠状态、取食、饮水、鸣叫）的频率、时长及光暗调制年龄变化，证明行为衰老是行为特异性过程而非统一衰退，为比较衰老研究提供框架。论文发表于《Journal of Insect Behavior》。
关键技术方法上，研究人员使用购自日本群马县Tsukiyono Farm的终龄若虫羽化为成虫的雄性双斑蟋蟀，初始11只因数据质量排除3只，最终样本为8只个体，平均成年寿命36.9±16.3天（范围20.7至70.0天），单只饲养于透明丙烯酸容器，12:12小时光暗周期（光相06:00至18:00，30°C）下自由取食饮水。成像采用树莓派（Raspberry Pi）NoIR相机每0.5分钟抓拍一次RGB图像，光相白光LED、暗相红外LED连续照明。姿态估计用DeepLabCut（基于ResNet-50深度学习网络）标注头、胸、腹、腹端、左右后腿六个关键点，提取每帧xy坐标；行为按优先级流程分类为鸣叫、取食、饮水、运动（腹部位移≥6像素）、类睡眠状态（连续不动≥10帧即≥5分钟）、静息（<10帧）、其他；腹部位移欧氏距离算总路程。统计上把寿命归一化到[0,1]分早中晚三段，用Friedman检验逐ZT（Zeitgeber time，授时因子时间） Bin比较，相位均值用配对Wilcoxon符号秩检验加BH-FDR校正，24小时cosinor与连续小波变换（continuous wavelet transform, CWT）析昼夜节律，Poisson/Gaussian广义估计方程（generalized estimating equation, GEE）与广义线性混合模型（generalized linear mixed model, GLMM）控小时与个体效应，样条回归与广义可加模型（generalized additive model, GAM）验连续年龄趋势，Spearman秩相关析行为间变化耦合。
研究结果部分，首先DeepLabCut追踪显示三次训练损失稳定下降，六关键点置信度0.8至1.0且个体间变异小，下游量化可靠。运动与总路程小节指出，运动在暗相起始出现峰值且随龄减弱；Friedman检验在ZT15、ZT18显著，相位均值中暗相运动在中晚期较早期降低（q<0.05），24小时cosinor振幅晚期最低，CWT显示22至26小时 circadian 频段功率早期最高晚期降，GEE/GLMM证实中晚期运动与路程显著低于早期，GAM同样预测终点值更低，说明老化伴暗相运动减少与每日振幅衰减。静息小节显示静息在暗相起始增多，ZT14有阶段差，相位均值无清晰年龄趋势，cosinor振幅晚期降低，CWT功率晚期降，GLMM中晚期静息低于早期，GAM支持整体下降。类睡眠状态（SLS）小节指出SLS光相高、暗相骤降，ZT0、2、9、13、14、15、19、20、21、22有阶段差，暗相SLS随龄明显上升（q<0.05），cosinor中期mesor升、振幅晚期降，CWT circadian功率晚期减，GEE/GLMM中晚期SLS高于早期，GAM支持随龄增加，表明SLS增尤以暗相为主而节律振幅衰减。取食与饮水小节表明两组为无群体水平昼夜节律、早中晚期ZT剖面相似、无光暗差与年龄差。鸣叫小节显示鸣叫暗相高于光相（配对Wilcoxon p=0.039），早中晚期均数早高晚低（q<0.05），说明雄性鸣叫兼具相位与年龄依赖。相关性小节用晚期减早期变化做Spearman相关，鸣叫下降与SLS上升显著负相关（ρ=-0.738, p=0.037），与运动变化不相关（ρ=0.238, p=0.570），提示鸣叫衰退不反映全身运动衰退而与类睡眠静止增加有关。
讨论与结论翻译部分，研究人员总结：本研究给出双斑蟋蟀成年全寿命长期多行为衰老分析，运动、静息、SLS、鸣叫随龄变而取食饮水稳；这些具昼夜结构的行为在晚年期仍保24小时时间组织但振幅与量级行为特异地变，CWT与模型分析支持节律强度衰减。鸣叫具光暗调制且早至中年期锐减，虽受0.5分钟采样限制，但作为雄性生殖通讯行为其衰退或反映生殖衰老组分，且个体水平与运动无关、与SLS共变，类比果蝇中运动与求偶可走不同轨迹、涉及神经调质而非外周运动退化。老蟋蟀未丧失光暗结构，仅减弱输出幅度，类似老果蝇中枢振荡器稳而行为节律弱；本研究未直接测分子钟，该解离待验证。运动衰退或兼因时序输出通路（如PDF信号）劣化与背纵肌蛋白合成龄相关下降。结论上，双斑蟋蟀行为衰老非全域一致衰退而是行为特异性改变日常活动模式与输出；鸣叫与运动衰老在种内解离表明生殖与运动衰老可独立调控，凸显非模式昆虫对识别共有与谱系特异衰老特征的价值；局限含n=8统计力弱、取食饮水仅靠头部坐标判据未计量摄入、0.5分钟间隔漏采短暂鸣叫；低成本的树莓派延时加DeepLabCut框架适于跨物种比较，但单养雄性未含社会生态复杂度，隔离本身改变蟋蟀生理行为，自然种群轨迹或异。该研究为蟋蟀及其他非传统昆虫模型的行为衰老机制研究提供了基线框架。
