肉类产品中肠道病毒检测方法性能评估

《Brazilian Journal of Microbiology》：Performance evaluation of methods for detecting enteric viruses in meat products

　　

肉类产品是食源性病毒传播的重要载体，然而针对此类复杂基质的标准化检测方法仍十分有限。研究人员系统比较了三种病毒回收方法在代表鸡肉、猪肉及加工熟肉制品共九种肉类产品中的表现：聚乙二醇6000（PEG 6000）沉淀法、甘氨酸缓冲液-氯仿（GBC）相分离法以及β-巯基乙醇（B-M）促变裂解法。以鼠诺如病毒1型（MNV-1）和鼠肝炎病毒3型（MHV-3）作为过程对照，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）评估回收效率。B-M法表现出最稳定的性能，在所有测试基质中均成功检出MNV-1，且在鸡肉与猪肉中对MNV-1的回收显著优于PEG法与GBC法。将B-M法应用于25份商业零售产品，研究人员在四份样本中检出乙型肝炎病毒（HEV）遗传物质，一份样本中检出猪圆环病毒2型（PCV-2）遗传物质，且均仅见于猪肉产品。这些发现为肉类病毒监测中的方法选择提供了关键的比较性能数据，并记录了巴西圣卡塔琳娜州商业猪肉产品中HEV与PCV-2遗传物质的存在，凸显了该重要肉类生产与出口州显著的食品与农业生物安全问题。

研究背景与立项依据

食源性疾病是全球公共卫生负担，肠道病毒因低感染剂量、高环境稳定性及高效人际传播成为食源性暴发的主要病原。肉类产品因生产规模大、供应链复杂，且可通过感染者交叉污染、屠宰环节环境污染及动物组织直接人畜共患传播而携带病毒。非包膜肠道病毒（如诺如病毒）在肉类中可存留数周，而HEV基因型3和4可经猪肉、野猪和鹿产品直接人畜共患传播。目前ISO 15216-1:2017仅涵盖双壳贝类、叶菜、浆果和水，排除肉类，原因是肉基质高蛋白、高脂会抑制聚合酶并干扰核酸提取，且污染量常近检测限，亟需敏感高效的回收方法。在此背景下，研究人员在巴西圣卡塔琳娜州开展研究，系统评估三种回收法在九种肉类基质中的表现，并将最优法用于25份零售肉品筛查。

主要技术方法概述

研究人员选取圣卡塔琳娜州2024年5—6月超市购买的九种肉品（鸡胸/翅/腿、猪肋排/五花/碎肉、意大利萨拉米/殖民萨拉米/coppa）及25份商业零售品（含生切肉与手工香肠），以MNV-1（非包膜替代诺如病毒）和MHV-3（包膜鼠冠状病毒替代）为过程对照进行回收率评估；采用PEG 6000沉淀法、GBC相分离法、B-M促变裂解法三种前处理，核酸提取后用RT-qPCR/qPCR（TaqMan探针）靶向MNV-1、MHV-3、NoV、HAV、HEV、RVA、RVC、PAdV、PCV-2，以Cq≤40且双复孔一致为阳性判据，用Kruskal-Wallis与Dunn检验比较矩阵内方法差异。

研究结果

矩阵特异性回收模式

对MNV-1，B-M法在鸡（均值29.454%±33.059%，翅达71.745%±7.418%）和猪（6.407%±1.705%）基质回收最高且稳定，PEG法散在低位，GBC法在鸡猪中全无定量回收；禽类回收高于猪肉因低脂高湿利于洗脱。对MHV-3（包膜病毒），无单一方法全域占优：鸡中PEG均值最高（2.785%±3.210%）但B-M更稳定；猪中B-M最优（0.198%±0.231%）；熟肉基质全法均低，GBC意外最高（0.392%±0.567%）。统计上MNV-1在鸡猪中B-M显著优于PEG（p=0.013）与GBC（p=0.001）；MHV-3在鸡中PEG优于GBC，猪中B-M优于GBC，熟肉中GBC优于B-M。

浓缩方法的优势与局限

B-M法依赖β-巯基乙醇破坏蛋白二硫键、RLT（含异硫氰酸胍的变性缓冲液）促变裂解，缩短流程、降低肌红蛋白/血红蛋白等PCR抑制剂共提，适合高通量分子监测；但其过程对照加至0.25 g匀浆亚铝而非初始样，可能抬高回收率，且β-巯基乙醇破坏衣壳不能获活病毒，仅限核酸检测。PEG法可保留活病毒利于细胞感染实验，但在肉中同步沉淀色素蛋白致抑制剂共提、时长、重复性差。GBC法以0.25 M甘氨酸缓冲液（pH 9.5）替TRI Reagent?致非包膜病毒回收崩塌，仅熟肉中MHV-3因氯仿除脂略优，但氯仿灭活包膜病毒且细胞毒。

基质组成对回收的影响

鸡品脂肪低回收高；熟肉高盐低湿加腌制剂吸附病毒，全法最低；猪肉介于其间。

肉品调查结果

用B-M法筛25份零售品，5份（20%）阳性，仅HEV（4份，16%，Cq 36.79–37.83，含3份香肠1份五花）与PCV-2（1份香肠，4%，Cq 37.12），全源自猪肉，NoV/HAV/RVA/RVC/PAdV未检。高Cq示低载量，qPCR不能区分死活核酸，但作为猪群HEV/PCV-2循环的生物指示仍具农卫意义；16%与屠宰期猪胆汁15.2%、乌拉圭粪样16.6%相近，证实屠宰内源病毒穿透工业加工至零售。

方法学挑战

肉基质抑制剂（肌红蛋白、血红蛋白、脂、胆盐）致假阴；各法起始质量不同（PEG 25 g、GBC 7 g、B-M 5 g取0.25 g提取）影响抑制剂负荷与检出概率；B-M以小体积低抑制剂换代表性，靠5 g预匀浆补偿；未测经验LOD₅₀，按10 GC/μL分析限推理论需10⁵ GC/g（假设100%提取率）；接种病毒等电点异于自然病毒，但自然样检出HEV/PCV-2证方法有效。

讨论与结论翻译

研究人员指出，B-M法在生鸡生猪肉类对非包膜MNV-1回收稳定优于PEG与GBC，其机制为β-巯基乙醇还原解离与变性缓冲液抑抑制剂共提；但过程对照加入时点差异使绝对回收率可能被高估，且β-巯基乙醇致病毒失活仅适分子检测。PEG可获活病毒但抑步多变异大，GBC替缓冲液后性能坍缩仅在熟肉包膜病毒因氯仿除脂暂优。基质上禽优于猪优于熟肉，熟肉高盐低湿为全法瓶颈。零售调查HEV 16%与PCV-2 4%全在猪肉（香肠为主），与国际肌肉型香肠低阳性（0–2%）比偏高，归因于圣卡塔琳娜猪群高血清流行、加工混料与设备交叉污染及B-M高敏回收。研究受限局部采样（n=25）不能外推全国，但给出该供应链基线。结论：B-M法为鸡肉猪肉非包膜肠道病毒分子监测最一致选择，25份圣卡塔琳娜零售猪肉中HEV与PCV-2遗传物质存在凸显主要产肉出口州食品与农业生物安全关切，ISO体系缺肉品标准亟待补位。