整合单细胞与实验分析揭示GPRC5B在绝经后骨质疏松症巨噬细胞衰老相关改变中的作用

《Frontiers in Immunology》：Integrated single-cell and experimental analyses implicate GPRC5B in macrophage senescence-related alterations in postmenopausal osteoporosis

　　

摘要
背景：绝经后骨质疏松症（post-menopausal osteoporosis, PMO）以衰老、雌激素缺乏、免疫失调和进行性骨丢失为特征，然而参与PMO的分子改变仍未完全阐明。
方法：将单细胞和转录组分析与机器学习及实验验证相结合。采用去卵巢小鼠模型、原代骨髓来源巨噬细胞和RAW264.7细胞评估基因表达、衰老相关改变、巨噬细胞极化和相关信号通路。
结果：单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）揭示了PMO中骨髓微环境的显著重塑，并鉴定出载脂蛋白E阳性（apolipoprotein E-positive, APOE⁺）巨噬细胞为具有升高的KRAS相关信号的优势亚群。整合的共表达和机器学习分析得出GPRC5B为PMO相关候选基因，其在多个数据集中一致性上调。在体内和体外实验中，GPRC5B敲低可减弱巨噬细胞的衰老相关改变、减少炎症激活、促进M2样特征并改善对凋亡成骨细胞的吞噬清除。机制上，GPRC5B与DLG1/Kv1.3相关信号相关联，救援实验支持该轴参与巨噬细胞表型。在PMO小鼠中，GPRC5B敲低伴随骨结构改善的明显趋势，且该效应在DLG1抑制后增强。药物特征筛选和分子对接分析进一步确定多拉菌素（Doramectin）为候选化合物，在雌激素剥夺条件下其处理与GPRC5B表达降低相关。
结论：GPRC5B是通过整合转录组分析鉴定并得到初步功能实验支持的巨噬细胞富集型PMO相关候选基因。这些发现提示GPRC5B可能参与PMO中巨噬细胞相关改变，并值得进一步的机制和转化研究。

论文解读文章

研究背景与问题

绝经后骨质疏松症（post-menopausal osteoporosis, PMO）是老年女性最常见的代谢性骨病之一，以骨量减少、骨微结构退化和脆性骨折风险增加为主要特征。随着全球预期寿命延长，骨质疏松性骨折不仅损害活动能力和生活质量，还显著增加残疾、住院和死亡风险。尽管抗骨吸收和促骨形成疗法改善了临床管理，仍有相当比例的患者出现进行性骨丢失、长期获益有限或治疗相关不良反应。因此，需要更深入地阐明PMO的分子和细胞机制，并寻找更有效的治疗靶点。长期以来，PMO主要被视为雌激素缺乏的后果，但越来越多的证据表明其发病机制超越内分泌失衡，涉及骨髓微环境中的慢性低度炎症、免疫失调和年龄相关细胞功能障碍。其中，细胞衰老已成为骨骼老化和骨质疏松的重要促成因素。衰老细胞在骨组织中累积，分泌促炎和组织重塑介质，扰乱成骨细胞和破骨细胞的协调活动，从而加速骨丢失。巨噬细胞作为骨稳态中的重要免疫群体，具有高度可塑性，参与炎症调节、成骨支持、破骨生成调节以及组织重塑中凋亡细胞的清除。在病理条件下，巨噬细胞功能障碍可使骨髓龛转向持续炎症、组织修复缺陷和成骨支持受损。衰老巨噬细胞不仅是衰老组织中的旁观者，还因异常极化、过度炎症反应和胞葬能力降低而成为组织退化的主动驱动因素。然而，连接巨噬细胞衰老与PMO进展的分子调控因子仍不明确。G蛋白偶联受体C类5组成员B（G protein-coupled receptor class C group 5 member B, GPRC5B）是一种孤儿G蛋白偶联受体，因其在炎症调控、免疫细胞行为和疾病相关组织重塑中的作用而受到关注，但其是否通过调控巨噬细胞功能障碍和衰老参与PMO尚未确立。下游机制方面，DLG1是一种支架蛋白，参与组织膜相关信号复合物并调节电压门控钾通道Kv1.3的稳定性，而Kv1.3与炎症激活、免疫细胞功能极化和衰老相关信号有关。因此，研究人员提出GPRC5B可能通过DLG1/Kv1.3依赖通路调控巨噬细胞衰老。

主要技术方法概述

研究人员整合了单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、批量转录组数据集、共表达网络分析、机器学习和实验验证。公共单细胞数据来自GEO数据库的GSE147287和GSE169396，其中来自老年女性骨质疏松注释样本被归为PMO注释组，其余样本作为可比较组。批量转录组数据集GSE56815（绝经后女性高/低骨密度各20例）用于特征选择和诊断模型构建，GSE7158（14例高峰值骨量和12例低峰值骨量）及GSE7429（10例高骨密度和10例低骨密度外部绝经后B细胞队列）用于外部验证。单细胞数据使用Seurat处理，经Harmony批次校正、DoubletFinder去双细胞，基于典型标志基因和SingleR注释细胞类型。利用CellChat分析细胞间通讯，通过irGSEA框架整合八种算法评估KRAS信号通路活性。使用高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）鉴定与APOE⁺巨噬细胞相关的基因模块。运用XGBoost和LASSO回归对GSE56815队列进行特征选择。药物预测通过Enrichr平台的DSigDB数据库完成，并使用AutoDock Vina进行分子对接。实验方面，建立2月龄和23月龄小鼠的去卵巢（ovariectomy, OVX）PMO模型，每组5只，分为年轻假手术、年轻OVX、老年假手术和老年OVX组。分离原代骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMMs），培养RAW264.7细胞系。采用小干扰RNA（siGPRC5B）沉默基因，用H₂O₂诱导细胞衰老，用雌激素受体拮抗剂Fulvestrant联合无酚红培养基和炭剥离血清模拟雌激素剥夺微环境。通过蛋白质印迹、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）染色、流式细胞术、RT-qPCR、ELISA、吞噬实验和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）等评估分子和细胞表型。体内实验中，OVX小鼠在术后一周接受骨髓腔内注射AAV-shGPRC5B以敲低GPRC5B，部分小鼠在术后两周经尾静脉注射DLG1抑制剂AVLX-144。使用显微计算机断层扫描（micro-CT）和免疫荧光染色评估骨结构和蛋白表达。

研究结果

单细胞转录组分析揭示APOE阳性巨噬细胞为PMO富集亚群且KRAS相关信号升高。对PMO注释样本和可比较样本的骨髓scRNA-seq数据进行分析，获得14,809个高质量细胞，分为21个簇并注释为10种主要细胞类型。PMO注释样本显示细胞组成重塑：骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）、浆细胞和巨噬细胞比例增加，中性粒细胞、B细胞和中性粒细胞祖细胞减少。细胞通讯分析显示广泛的生态位重连，BM-MSCs是主要信号源，T细胞是主要信号接收者，ANXA1-CAP1是突出的配体-受体对。KRAS信号活性在巨噬细胞中最高。巨噬细胞重聚类鉴定出六个亚群，其中APOE⁺、FTL⁺和SPP1⁺巨噬细胞在PMO中富集。APOE⁺巨噬细胞在PMO组中KRAS通路活性显著升高，并富集抗原呈递、细胞黏附、IgA相关免疫应答和溶酶体通路。hdWGCNA鉴定出与APOE⁺巨噬细胞最相关的基因模块，与KRAS通路基因交叉得到六个候选基因：ANKH、GYPC、GPRC5B、LY96、FUCA1和TMEM176B。

整合转录组和机器学习分析优先筛选GPRC5B为巨噬细胞富集的PMO相关候选基因。XGBoost和LASSO回归的交叉基因包括ANKH和GPRC5B，其中GPRC5B在XGBoost中排名最高。在三个独立PMO数据集中，GPRC5B一致性上调，而ANKH表达变化不稳定。受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析显示GPRC5B在各数据集中均有一定区分能力（GSE56815曲线下面积AUC=0.812；GSE7158 AUC=0.780；GSE7429 AUC=0.700）。进一步分析显示GPRC5B与免疫相关通路和免疫浸润特征（包括巨噬细胞、T细胞特征、主要组织相容性复合体分子、炎症反应、趋化因子和TNF家族成员）密切相关。单细胞定位显示GPRC5B在巨噬细胞中相对高表达，在APOE⁺亚群中最高。GPRC5B阳性巨噬细胞与多种细胞群体（特别是中性粒细胞和T细胞）显示出增强的细胞间通讯。

GPRC5B在PMO相关巨噬细胞中上调，并与衰老相关和功能改变相关。在2月龄和23月龄OVX小鼠模型中，micro-CT显示OVX和衰老导致骨结构恶化，老年OVX小鼠骨小梁丢失明显。与2月龄假手术组相比，2月龄OVX组和23月龄假手术组GPRC5B均显著上调；与23月龄假手术组相比，23月龄OVX组GPRC5B表达也显著增加。免疫荧光证实GPRC5B在股骨组织F4/80⁺巨噬细胞中表达。原代BMMs中得到类似结果。SA-β-gal染色显示老年OVX小鼠原代BMMs的衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加，GPRC5B敲低后降低。在RAW264.7细胞中，H₂O₂处理诱导细胞衰老，而GPRC5B沉默有效降低GPRC5B表达、抑制IL-1β表达、减少β-Gal阳性细胞、减弱向CD86阳性M1极化的转变并部分恢复CD206阳性M2特征。荧光示踪显示GPRC5B敲低增强衰老巨噬细胞对凋亡成骨细胞的吞噬摄取。

GPRC5B相关巨噬细胞表型涉及DLG1/Kv1.3相关信号。通过将HitPredict预测的GPRC5B相互作用蛋白与GeneCards中巨噬细胞衰老相关靶点相交，获得12个候选蛋白。Co-IP支持GPRC5B与DLG1存在于同一蛋白复合物中。蛋白质印迹显示，在原代BMMs和RAW264.7细胞中GPRC5B敲低均降低DLG1及其下游通道蛋白Kv1.3的表达。在H₂O₂处理的RAW264.7细胞中进行救援实验：GPRC5B沉默减少DLG1和Kv1.3表达，而DLG1过表达增加DLG1和Kv1.3水平。GPRC5B敲低减弱β-Gal染色、抑制IL-1β表达、抑制M1极化并促进M2特征，而DLG1过表达基本逆转了这些效应。

GPRC5B敲低改善骨表型，多拉菌素被确定为与GPRC5B表达相关的候选化合物。在GPRC5B敲低PMO小鼠中，原代BMMs的GPRC5B、DLG1和Kv1.3蛋白表达降低，DLG1抑制后进一步降低。代表性micro-CT重建显示AAV介导的GPRC5B敲低后骨结构保留有改善趋势，DLG1抑制剂联合治疗组进一步改善。SA-β-gal染色显示GPRC5B敲低后原代BMMs衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低，联合DLG1抑制剂进一步降低。药物预测方面，DSigDB筛选的前20个候选化合物中多拉菌素预测评分最高，分子对接支持其与GPRC5B稳定结合。在雌激素剥夺条件下，RAW264.7细胞形态发生改变，GPRC5B mRNA和蛋白表达增加，促炎细胞因子TNF-α分泌增加，抗炎因子IL-10减少。多拉菌素处理以剂量依赖方式抑制GPRC5B表达，10 μM时显著抑制，20 μM时无明显进一步降低。

总结与讨论

该研究通过整合单细胞、批量转录组和实验分析，将GPRC5B鉴定为PMO中巨噬细胞相关的候选分子。数据显示GPRC5B与衰老相关巨噬细胞改变、炎症和吞噬功能改变及骨表型相关，可能涉及DLG1/Kv1.3相关信号。研究结果支持PMO不仅是雌激素撤退和破骨细胞过度激活的疾病，还涉及更广泛的骨髓免疫微环境紊乱。巨噬细胞衰老并非仅表现为生长停滞标志物变化，而是伴随炎症和功能失衡的广泛程序。单细胞分析表明PMO选择性富集与病理信号程序偶联的巨噬细胞状态。GPRC5B在多个独立数据集中稳定上调且具有功能相关性，使其区别于单纯诊断标志物。DLG1/Kv1.3轴的参与为转录组发现联系到明确下游通路提供了深度。体内GPRC5B敲低伴随骨结构改善趋势和巨噬细胞衰老减少，DLG1抑制增强保护效应，提示靶向巨噬细胞衰老通路可能成为PMO的替代或补充治疗策略。多拉菌素作为候选化合物初步提示GPRC5B具有药理可靶向性。

研究结论部分翻译如下：总之，本研究整合单细胞、批量转录组和实验分析，将GPRC5B鉴定为PMO中巨噬细胞相关候选基因。数据支持一种模型，即GPRC5B与衰老相关巨噬细胞改变、炎症和吞噬功能改变及骨表型相关，可能涉及DLG1/Kv1.3相关信号。尽管这些发现仍属初步并需进一步的机制验证，但它们扩展了当前对PMO中免疫相关改变的认识，并为未来研究GPRC5B在骨质疏松相关骨髓重塑中的作用提供了基础。