《Environmental Science: Advances》：Deciphering the toxicity of diclofenac toward human β2-adrenergic receptor and PPAR-γ and evaluating its biodegradation potential by bacterial dye-decolorizing peroxidase via in silico approachesOpen Access
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双氯芬酸被认为是一种新兴污染物，由于不当处置和传统污水处理系统的局限性，其在地表水和废水中被频繁检出。双氯芬酸对人类和水生生态系统构成显著威胁。本研究采用分子对接和分子动力学（MD）模拟的整合计算方法，探讨染料脱色过氧化物酶（DyP）对双氯芬酸及其衍生物的修复
双氯芬酸被认为是一种新兴污染物，由于不当处置和传统污水处理系统的局限性，其在地表水和废水中被频繁检出。双氯芬酸对人类和水生生态系统构成显著威胁。本研究采用分子对接和分子动力学（MD）模拟的整合计算方法，探讨染料脱色过氧化物酶（DyP）对双氯芬酸及其衍生物的修复能力。毒性预测及多项研究强调了双氯芬酸对人体的毒性。分子对接揭示双氯芬酸与人类靶蛋白β2-肾上腺素能受体（ADRB2）和PPAR-γ之间具有强结合亲和力，表明这些蛋白可能代表毒性的潜在分子相互作用靶点。为评估DyP的生物修复效率，研究人员对DyP与双氯芬酸及其衍生物进行了分子对接。双氯芬酸葡萄糖醛酸苷表现出最高的结合亲和力（?7.0 kcal mol?1），提示其作为生物修复介质的潜力。MD模拟和MM/GBSA分析表明复合物具有稳定性，显示出有利的结合自由能（ΔGbind = ?55.17 ± 0.66 kcal mol?1），支持持续配体结合及DyP用于双氯芬酸生物降解的潜力。
双氯芬酸（diclofenac）是一种广泛使用的非甾体抗炎药（NSAID），因污水处理厂无法完全去除而持续在河流、地下水乃至食物中被检出。其生态风险已有充分记录，从鱼类激素干扰到微生物群落应激，且长期低剂量暴露对人体健康影响的证据日益增多。本研究显示，双氯芬酸与两种人类蛋白——β2-肾上腺素能受体和PPAR-γ——强烈结合，进一步加重了对其生理效应的担忧。研究还发现，细菌染料脱色过氧化物酶（DyP）在100 ns分子动力学模拟中能以稳定、有利的构象结合双氯芬酸及其主要代谢物双氯芬酸葡萄糖醛酸苷，表明酶促降解具有实际潜力。这为处理制药废水、减轻该污染物负担提供了一条低成本、基于酶的途径。
### 研究背景与问题
双氯芬酸是一种全球广泛使用的非甾体抗炎药（NSAID），常用于人类和动物的疼痛缓解。由于药物消费量增加、医药废弃物处置不当、工业废水排放以及现有污水处理厂对双氯芬酸及其衍生物降解能力不足，该药物在地表水、制药工业废水、医院和 household 废物中频繁检出，甚至累积于可食用果蔬中，被视为新兴污染物。双氯芬酸对哺乳动物具有肝毒性、神经毒性、心脏毒性、遗传毒性和肾毒性等多重负面效应，可引起血红蛋白、红细胞、总蛋白、白蛋白和红细胞压积降低等血液学毒性。其衍生物如N,5-二羟基双氯芬酸可因胞质钙升高导致细胞死亡；双氯芬酸葡萄糖醛酸苷、4-羟基双氯芬酸和5-羟基双氯芬酸等可抑制大鼠肝线粒体ATP合成。传统化学修复技术成本高且可能产生二次污染物，因此需要安全环保的生物修复替代方案。
染料脱色过氧化物酶（DyP）是细菌和真菌来源的血红素过氧化物酶，能够降解芳香族污染物。本研究中使用的DyP源自结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），该菌株具有活性DyP且结构已被高分辨率解析，具有明确的heme结合架构和实验验证，是计算研究的合适代表模型。DyP的催化机制涉及过氧化氢活化、电子转移反应和底物氧化，可将污染物降解为毒性较低的物质。理解药物污染物与DyP的分子相互作用是研究其降解潜力和污水处理应用的关键。
### 研究内容与结论
本研究旨在通过整合计算策略探究DyP对双氯芬酸及其衍生物的生物降解潜力。通过ProTox-3.0毒性预测、分子对接、100 ns分子动力学（MD）模拟、MM/GBSA结合自由能计算等系统分析，获得以下主要发现：毒性预测显示双氯芬酸葡萄糖醛酸苷具有肾毒性和呼吸系统毒性高风险，毒性等级为3级；分子对接显示双氯芬酸及衍生物与人源ADRB2和PPAR-γ蛋白强结合，提示潜在的毒性分子靶点；DyP与10种双氯芬酸相关化合物均表现出强结合亲和力（?7.0至?5.2 kcal mol
?1），其中双氯芬酸葡萄糖醛酸苷结合最强（?7.0 kcal mol
?1）；MD模拟证实DyP-双氯芬酸复合物在100 ns内保持稳定，MM/GBSA计算给出有利的结合自由能（ΔG
bind = ?55.17 ± 0.66 kcal mol
?1），表明DyP具有双氯芬酸生物降解的潜力。该研究发表于《Environmental Science: Advances》。
### 主要技术方法
研究采用了以下关键技术方法：使用ProTox-3.0网络工具基于机器学习模型预测化合物毒性；从RCSB PDB数据库获取DyP（UniProt I6Y4U9）、ADRB2（PDB ID: 2RH1）和PPAR-γ（PDB ID: 3DZY）的蛋白质结构；使用ExPASy ProtParam计算蛋白质理化性质；从PubChem获取10种双氯芬酸相关化合物结构；利用DeepSite（基于DCNN的神经网络预测器）预测DyP活性位点；采用PyRx软件进行分子对接；使用OpenMM引擎和AMBER ff19SB力场进行100 ns MD模拟，系统加入NaCl离子和TIP3P水模型，配体拓扑由GAFF2生成；采用MM/GBSA方法计算结合自由能。样本来源包括结核分枝杆菌来源的DyP和智人（Homo sapiens）来源的ADRB2与PPAR-γ蛋白序列。
### 研究结果
**毒性分析（ProTox-3.0）**：双氯芬酸葡萄糖醛酸苷表现出高概率肾毒性和呼吸系统毒性，与细胞色素P450（主要为CYP2C9）有中等相互作用，乙酰胆碱酯酶（AChE）是显著分子靶点，毒性等级为3级，预测准确度100%。
**理化性质分析**：DyP最稳定（不稳定指数29.85），PPAR-γ分子量最高（57.62 kDa），ADRB2具有最高脂肪指数和正GRAVY值，疏水性更强。
**人源蛋白分子对接**：4′-羟基双氯芬酸与PPAR-γ结合能为?7.5 kcal mol
?1，通过Asn306常规氢键、Cys432 π-供体氢键、Phe313 π-π堆积及多个π-烷基相互作用稳定；双氯芬酸葡萄糖醛酸苷与ADRB2结合能为?10.1 kcal mol
?1，通过His93和Trp313氢键、Asp113 π-阴离子作用、Phe290和Phe193 π-π堆积等稳定。对接方案通过共晶配体重新对接验证，RMSD分别为0.40 ?（PPAR-γ）和0.68 ?（ADRB2）。
**活性位点预测**：DeepSite鉴定DyP三个结合腔，Site 1（P0）具有最高可成药性评分（0.81）、最大腔体体积（1516.08 ?3）和最大表面积，富含缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等非极性残基，适合容纳芳香族化合物，被选为后续对接位点。
**DyP分子对接**：10种化合物均显示强结合亲和力（?7.0至?5.2 kcal mol
?1），其中双氯芬酸葡萄糖醛酸苷最强（?7.0 kcal mol
?1），其次为5-羟基双氯芬酸（?6.9 kcal mol
?1）。相互作用涉及范德华力、常规氢键、碳-氢键、π-阴离子和π-σ键，距离范围3.5–6.15 ?。
**MD模拟**：RMSD显示初始5–10 ns平衡后稳定在7.5–9.5 ?，配体RMSD保持低值（1–2 ?）；RMSF平均波动2.12 ?，多数残基低于阈值，催化区域稳定；回旋半径平均21.46 ?，保持紧凑结构；配体-结合位点平均距离0.86 ?，表明双氯芬酸持续锚定于结合口袋；蛋白-配体总相互作用能平均?74.64 kcal mol
?1，其中范德华贡献?57.74 kcal mol
?1，静电贡献?16.93 kcal mol
?1；相互作用占有率分析显示TYR260、ILE258、VAL178、PHE257、GLY259等残基占有率接近100%，HIS179和PHE257的氢键贡献稳定性；质心距离平均3.40 ± 0.60 ?，70–80 ns间出现更紧密结合；PCA显示平滑构象转变和稳定簇；SASA分析显示总SASA平均355.8 nm2，蛋白SASA平均168.9 nm2，配体SASA平均6.89 nm2，无显著构象展开。
**MM/GBSA分析**：平均结合自由能ΔG
bind = ?55.17 ± 0.66 kcal mol
?1，范德华能（?59.8 kcal mol
?1）和静电能（?28.6 kcal mol
?1）为主要驱动力，不利溶剂化能（+33.2 kcal mol
?1）被抵消。残基能量分解鉴定PHE257、ILE258、VAL178、GLY259、HIE179、TYR260和THR267为主要稳定残基，与高占有率残基高度重叠。
### 讨论总结与结论翻译
讨论部分指出，双氯芬酸作为广泛使用的NSAID，频繁检出对生态造成不利影响。ProTox-3.0毒性预测（等级3，100%准确度）验证了其毒理学相关性，ADRB2和PPAR-γ对接结果进一步提示双氯芬酸可能影响信号通路，但功能后果需实验验证。DyP通过保守远端三元组（天冬氨酸和精氨酸）启动催化循环，小分子底物直接进入heme通道，而双氯芬酸等大分子可能通过长程电子转移（LRET）途径氧化。对接结果（?7.0至?5.2 kcal mol
?1）表明DyP可识别这些化合物，与已有锰过氧化物酶降解蒽醌类研究（?9.3至?8.2 kcal mol
?1）相比，亲和力差异归因于分子大小和酶口袋结构。100 ns MD模拟综合RMSD、RMSF、Rg、SASA、PCA和MM/GBSA分析一致证明复合物稳定。研究局限性在于结核分枝杆菌不适合直接环境部署，实际应用需依赖分离的DyP蛋白；计算证据需通过生化实验、酶动力学、细胞毒性和生物降解实验验证。
结论部分翻译：该研究强调了双氯芬酸持续存在的环境问题及其对人类和生态系统的不利影响。由于过度使用，活性药物成分（APIs）在周围环境中被检出。毒理学和分子对接结果表明双氯芬酸可能与人源靶蛋白发生毒性相关相互作用。通过分子对接和MD模拟研究了DyP的生物降解潜力，计算分析显示DyP与双氯芬酸及其衍生物存在强相互作用，其中与双氯芬酸葡萄糖醛酸苷结合亲和力最高（?7.0 kcal mol
?1）。MD模拟进一步支持复合物在100 ns内的稳定性，RMSD、RMSF、回旋半径、配体结合距离、相互作用占有率和结合能谱均支持这一结果。疏水相互作用和范德华力在配体稳定性中起主要作用。MM/GBSA计算确认了有利的结合能量学，结合自由能为?55.17 ± 0.66 kcal mol
?1，为DyP-双氯芬酸复合物在模拟过程中保持能量稳定提供了额外证据。所有分析的综合结果提供了支持DyP生物降解双氯芬酸及其衍生物潜力的初步证据。实验验证需确认催化降解效果。这些发现有助于开发针对药物污染物的可持续生物修复策略，并展示了计算方法识别环境修复候选物的潜力。细菌和真菌DyP的比较研究可进一步解释药物污染降解效率差异，蛋白质工程和酶固定化是增强性能和应用性的可探索策略，此类研究可促进药物污染物生物降解技术的发展。
