厌氧–好氧切换触发活性污泥中腐殖质介导的羟基自由基生成：Fe–醌氧化还原网络的证据

《Environmental Science: Water Research and Technology》：Anaerobic–aerobic switching triggers humic-mediated hydroxyl radical generation in activated sludge: evidence for an Fe–quinone redox networkOpen Access

　　

摘要翻译：腐殖质（HS）改良的活性污泥系统常表现出改变且有时改善的处理性能，但这些效应背后的氧化还原和生化机制仍知之甚少。本研究考察了在中性pH附近、交替厌氧和好氧条件下运行的 supplemented with HSs 的活性污泥中是否会产生羟基自由基（·OH）。使用对苯二甲酸（TPA）作为化学探针，在从厌氧切换到好氧条件时立即反复触发尖锐的·OH脉冲，并在后续氧化还原循环后重新激活，表明污泥基质内具有可逆且可持续的氧化还原动态。在厌氧运行期间，Fe(II)积累至毫摩尔浓度，且主要以固体结合态存在，并在曝气时迅速消耗，同时伴随·OH生成。抑制实验确定H₂O₂和超氧化物是Fenton型反应中的关键中间体。蒽醌-2,6-二磺酸盐（AQDS）的微生物还原表明，本地微生物群落能在厌氧条件下主动还原类腐殖质氧化还原基团，证实了微生物电子穿梭的作用。这些结果表明，HS诱导的·OH生成可能有助于在HS改良污泥系统中有时观察到的增强处理效果。基于铁氧化还原动力学和简单的能量学考虑，研究人员提出了一个概念框架，其中偶联的腐殖质–铁氧化还原循环将厌氧电子积累与好氧氧化能力释放联系起来。本研究提供了实验证据，表明在过程相关的氧化还原振荡下，可再生的自由基生成可成为真实活性污泥的系统级特性。
水影响：已有报道称腐殖质添加可改善活性污泥废水处理性能，但其潜在机制尚不清楚。本研究表明，腐殖质改良污泥在厌氧–好氧循环中无需化学添加即可生成羟基自由基。这一发现提示原位氧化过程可能在改善处理性能中发挥潜在作用。

论文解读：

**研究背景与问题**
腐殖质（HS）是环境中广泛存在的大分子有机化合物，富含醌类等氧化还原活性官能团，能够在不同氧化还原电位下参与电子转移反应。在厌氧条件下，HS可作为腐殖质还原微生物的末端电子受体，生成氢醌类基团，进而将电子传递给Fe(III)氧化物，实现胞外电子传递（EET）。当体系重新暴露于氧气时，还原态HS和厌氧期积累的Fe(II)被快速再氧化，产生活性氧（ROS），包括超氧阴离子自由基（O₂^?·）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（·OH）。近年来研究表明，氧化还原振荡（还原与氧化条件反复循环）可显著增强含铁矿物和有机质的ROS产生。活性污泥工艺常采用厌氧–好氧交替运行以优化生物脱氮除磷和污染物降解，此过程中氧化还原电位（ORP）剧烈波动，可能驱动HS、铁、氧气和微生物群落之间的自持续氧化还原循环。然而，在实际活性污泥复杂基质中，操作相关的厌氧–好氧循环下·OH的系统性研究仍很有限，以往研究多采用提取HS、纯铁矿物或单菌种培养等简化模型系统，难以反映真实污泥环境中多种微生物种群、异质固相和多种氧化还原活性金属的相互作用。因此，研究人员开展本研究，考察腐殖质改良活性污泥在厌氧–好氧切换下是否产生·OH，并探讨HS在其中的贡献机制。

**研究内容与主要技术方法**
研究人员从日本熊本县水俣市一座采用腐殖质土壤改良的活性污泥工艺污水处理设施采集活性污泥样品，该设施处理人类排泄物和化粪池污泥。实验在100 mL玻璃反应器中进行，污泥悬浮液（MLSS 4000 mg L^?1）加入乙酸钠（12.2 mM）作为电子供体，对苯二甲酸二钠（TPA·2Na，5 mM）作为·OH化学探针。采用严格的厌氧（18 h，N₂吹扫）–好氧（6 h，空气曝气）循环操作，于30 °C、避光条件下进行。主要技术方法包括：高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）定量·OH与TPA反应生成的2-羟基对苯二甲酸（hTPA）；1,10-菲啰啉比色法测定溶解态Fe(II)和总Fe(II)，并计算固体结合态酸可提取Fe(II)池；通过高压灭菌、添加过氧化氢酶（CAT）和硝基四氮唑蓝（NBT）的抑制实验鉴别ROS中间体；利用模型醌化合物AQDS的厌氧还原实验验证微生物醌还原能力；从腐殖土和污泥中提取腐殖酸进行·OH生成批次实验；采用16S rRNA基因扩增子测序（Illumina MiSeq平台，QIIME2流程）分析微生物群落组成。

**研究结果**
**3.1 厌氧–好氧切换循环激活·OH生成**
通过两个完整的厌氧–好氧循环实验，研究人员发现hTPA浓度在厌氧期保持基线水平，而每次从厌氧切换到好氧后立即出现急剧上升。循环1中，6 h好氧期内累积hTPA从约2 μM增至7.5 μM；经历第二次厌氧期并重新曝气后，hTPA再次显著增加，表明·OH生成能力可重复激活。Fe(II)动态与·OH生成密切平行：厌氧期总Fe(II)积累至约2.4 mM，其中>95%为固体结合态酸可提取Fe(II)（Fe(II)_ads），溶解态Fe(II)（Fe(II)_dis）<0.1 mM。曝气开始后Fe(II)_tot迅速下降，至好氧期末约1.3 mM。该结果说明固体结合态Fe(II)池在氧化还原切换中反复再生和消耗，驱动可再生的·OH爆发。

**3.2 微生物活性贡献与ROS中间体**
高压灭菌污泥使hTPA积累量降低约70%，表明活性微生物群落对·OH生成至关重要，主要负责厌氧期还原醌基团和/或Fe(III)。在好氧期开始时添加CAT使hTPA积累减少约50%，证实H₂O₂是·OH上游的关键中间体。NBT也显著抑制hTPA形成，表明O₂^?·参与自由基级联反应。温度依赖性实验（30–50 °C）显示hTPA积累量随温度单调增加，约翻倍，说明好氧期反应主要由非酶化学氧化步骤控制。

**3.3 微生物对腐殖质模型醌的还原**
在厌氧条件下，活性污泥微生物能在12 h内将约90%的AQDS还原为AH₂QDS。应用含诱导期（t₀）的准一级动力学模型拟合，得到表观速率常数k′ = 0.26 h^?1，t₀ = 1.67 h（R² = 0.98），表明污泥微生物群落具有高效快速的醌还原能力，支持厌氧期HS醌基团可被微生物还原积累还原当量。

**3.4 提取腐殖酸及模型化合物的·OH生成**
从腐殖土（HSHA）和活性污泥（ASHA）中提取的腐殖酸在72 h曝气后均可产生可测量的hTPA，表明HS自身具有本底·OH生成能力，可能与痕量残余铁及还原态官能团的自氧化有关。HSHA经H₂S/N₂还原预处理后·OH生成显著增加，而添加Fe(NO₃)₃（Fe(III)）未增强生成，证实Fe(II)而非Fe(III)是相关Fenton催化剂。ASHA在相同条件下响应不同，可能因共提取的蛋白质等有机组分消耗·OH，或铁催化位点被络合掩蔽。对苯二酚（HQ）模型实验和电子自旋共振（ESR）波谱（POBN/DMSO自旋捕获）进一步证实了还原态醌与Fe(II)在·OH生成中的偶联作用。

**3.5 氧化还原缓冲容量与Fe–腐殖质体系能量学框架**
基于污泥含铁量约4 wt%和MLSS 4000 mg L^?1，计算得到总铁浓度约2.9 mmol Fe L^?1，对应约2.9 mmol e^? L^?1的氧化还原缓冲容量，与观察到的厌氧期Fe(II)_tot最大值（1.5–2.4 mM）一致，表明50–80%的总铁可在实验条件下被还原。研究人员借用Nernst方程和Gibbs自由能概念，将Fe–腐殖质复合氧化还原对视为有效阳极，O₂/H₂O对视为阴极，厌氧期微生物还原提高还原态比例（θ），降低阳极电位，储存氧化还原能量；曝气期累积的还原态物质被氧化，储存能量释放并驱动·OH生成。

**3.6 振荡氧化还原条件下的概念氧化还原网络与自由基生成**
综合实验结果，研究人员提出由四部分组成的动态氧化还原网络：微生物电子供体、HS醌/氢醌基团、Fe(III)/Fe(II)池和分子氧。厌氧期异养微生物通过EET途径将电子传递给HS醌基团（Q→QH₂或Q^?·），还原态HS随后将电子传递给Fe(III)氢氧化物生成Fe(II)。微氧条件下，半醌自由基（Q^?·）可与O₂反应生成O₂^?·。切换好氧后，氢醌被O₂氧化经半醌和O₂^?·生成H₂O₂，表面吸附的Fe(II)通过异相Fenton反应产生·OH。该网络可作为操作性“地质电池”，在厌氧期充电（储存还原当量），好氧期放电（释放氧化能力）。

**3.7 微生物群落组成**
16S rRNA基因测序显示，污泥中优势菌门为Pseudomonadota（41.0%）、Bacteroidota（19.5%）、Actinomycetota（6.3%）和Bacillota（3.5%）。其中Bacteroidota、Pseudomonadota、Actinomycetota和Bacillota四个门合计约占70%，与已知大多数腐殖质还原菌所在门类高度吻合，表明污泥微生物群落具备还原HS的代谢潜力。Bacillota中厌氧的Clostridia占比高于需氧的Bacilli，提示系统内存在适合异化腐殖质还原的厌氧生态位。

**讨论与结论**
讨论部分指出，实际活性污泥中TPA对·OH的捕获效率远低于简化体系中的约35%，因此hTPA检测值代表·OH实际产量的保守下限。CAT抑制不完全可能因H₂O₂在固液界面生成且CAT难以接近。ASHA与HSHA的不同响应提示污泥来源共提取物对·OH的竞争消耗或铁位点掩蔽。研究强调“地质电池”是操作性概念，仅描述醌/半醌/氢醌结构和偶联铁中心在反复氧化还原切换中的可逆储电/释电功能，而非整个腐殖质基质的定量储电行为。研究结论部分总结：第一，·OH生成在厌氧–好氧切换后立即发生，且可重复激活，表明氧化还原过程可逆可持续；第二，Fe(II)在厌氧期积累至毫摩尔浓度，主要为固体结合态酸可提取池，曝气时消耗并伴随·OH生成，CAT和NBT抑制实验支持H₂O₂和O₂^?·为关键中间体，符合表面相关Fenton型反应序列；第三，污泥微生物群落在厌氧下高效还原AQDS，直接证明微生物介导的类腐殖质电子穿梭，灭菌抑制实验确认活微生物对维持还原半循环不可或缺；第四，铁提供毫摩尔级氧化还原缓冲容量（估算2.9 mmol e^? L^?1），可在厌氧期充电、好氧期放电。最终结论支持腐殖质改良污泥在Fe–醌氧化还原网络中具有操作性地质电池功能，厌氧积累的还原当量在好氧期被部分转化为·OH生成能力。研究局限性包括：·OH绝对产量可能被低估；各ROS来源的相对贡献未完全分辨；Fe相矿物学身份未确定；结果基于单一HS富集污泥，普适性待验证；特定微量污染物转化未量化。未来需采用互补方法交叉验证ROS定量、解析Fe–醌相互作用机制，并在多种污泥系统和运行条件下评估。尽管存在这些限制，氧化还原切换可重复触发真实污泥基质中内源氧化脉冲的核心结论是稳健的，为后续过程导向研究提供了基础。