《Journal of Environmental Sciences》：Screening of putative pathogens by nanopore amplicon sequencing with unique molecular identifiers in urban rivers: An attempt for QMRA
编辑推荐：
•ONT-UMI 提高了测序读段准确性，并实现了可靠的细菌物种检测。•ONT-UMI 在城市河流中鉴定出数十种疑似病原体。•污水处理厂（WWTP）排放显著影响了城市河流中的细菌病原体群落。•估计城市河流饮用水处理所需的对数降低值（LRVs）小于 5 个对数单位。•开发病原体剂
- •
ONT-UMI 提高了测序读段准确性，并实现了可靠的细菌物种检测。
- •
ONT-UMI 在城市河流中鉴定出数十种疑似病原体。
- •
污水处理厂（WWTP）排放显著影响了城市河流中的细菌病原体群落。
- •
估计城市河流饮用水处理所需的对数降低值（LRVs）小于 5 个对数单位。
- •
开发病原体剂量反应数据是结合高通量测序（HTS）方法进行定量微生物风险评估（QMRA）所必需的。
引言
城市河流是重要的饮用水水源，然而污水处理厂（WWTPs）排放进这些河流的污水出水带来了显著的微生物风险 (Chen et al., 2024)。例如，Pang 等人 (2019) 使用定量实时聚合酶链式反应 (qPCR) 在 75 % 的下游样本中检测到了人类轮状病毒，而 Pascual-Benito 等人 (2020) 报告称使用 16S rRNA 基因（以下简称 16S）扩增子测序发现下游病原体属（如 Escherichia 和 Shigella）的丰度更高。反向定量微生物风险评估（QMRA）是管理受污水处理厂影响的城市河流中细菌病原体风险的有前途的工具，因为它有助于确定所需的对数降低值（LRVs），以指导饮用水处理设计和风险管理策略。例如，Azuma 等人 (2022) 表明，淀川中浓度为 6 CFU/mL 的 Staphylococcus aureus 需要 1.7 的 LRV 才能满足每人每年 10?? 感染的饮用水健康目标。然而，这些研究依赖于培养或 PCR 方法，这些方法受限于其非假设自由和通量低的特性，可能导致对高风险病原体的忽视。为了缓解这些挑战，高通量测序（HTS）因其广泛的病原体检测能力和潜在的定量分析潜力而成为一种有前途的替代方案。
对于 HTS 测序，Oxford Nanopore Technologies (ONT) 以其较低的初始成本和具备现场、实时分析能力而脱颖而出，使其在未来微生物监测中极具前景。值得注意的是，ONT 是一项长读长技术，可以实现物种水平的分辨率以澄清致病性。最近，ONT 宏基因组测序已被用于休闲用水和污水中致病菌种鉴定和 QMRA 中的定量分析 (Yang et al., 2023; Ni et al., 2026)。然而，将宏基因组测序应用于饮用水系统面临着许多挑战的复杂化：例如，低生物量需要大样本体积并降低灵敏度，而数据处理复杂且成本高昂。相反，全长 16S (FL-16S) 的初始扩增可能是解决细菌病原体检测这些瓶颈的合适方法，因为它具有物种鉴定的潜力 (Johnson et al., 2019)，以及全面且易得的生物信息学资源。
然而，ONT 测序面临着 2 %-9 % 较高序列错误率 (R9.4.1 和 R10.4.1) (Zhang et al., 2023) 的挑战，影响了分类分配准确性。共识调用是一种常见的错误校正方法，从源自相同模板的读段群集生成准确的共识序列，但 ONT 读段错误显著降低了读段聚类效率。唯一分子标识符（UMIs）可以提高读段聚类精度，增强共识调用效率。基于 UMI 的 ONT 测序显示出显著的准确性提升，在模拟群落分析中实现了高达 99.99 % 的准确性 (Karst et al., 2021; Lin et al., 2024)。尽管取得了这些进展，该方法尚未被用于病原体检测。
本研究首次应用基于 UMI 的 ONT FL-16S 测序（以下简称 ONT-UMI）来筛选受污水处理厂影响的城市河流中的细菌病原体，并评估其用于反向 QMRA 的潜力。为了对标 ONT-UMI 性能，我们首先将其与 Illumina 短读长测序进行比较，后者目前是扩增子测序中最广泛采用的平台，因其高序列准确性和成熟的生物信息学流程。使用 ONT-UMI 方法，本研究随后检测了城市河流中的致病细菌物种，并估计了这些河流饮用水处理所需的 LRVs。本研究将增强对污水处理厂排放所归因的微生物风险的理解，支持水安全管理，并可能对当前 QMRA 方法的创新做出贡献。
章节摘要
水样采集
采样于 2022 年 9 月至 11 月在日本桂河流域进行（图 1）。UR_A-C 位于几个污水处理厂的下游，其中 UR_A 上游特征为低污水出水混合比（约占河流流量的 3 %，见文本 S1）。UR_B 位于大型污水处理厂下游，混合比高（约 40 %）。UR_C 位于饮用水处理厂（DWTP）取水口附近，混合比适中（约 10 %）。为进行比较，从
ONT-UMI 性能评估
NBRC 模拟群落使用 ONT-UMI 方法进行分析。分析了每条序列的准确性。未抛光的读段平均错误率为 1.78 %，而纠错后的共识读段将其降低至仅 0.05 %（图 2a）。此外，达到 > 99 %、> 99.9 % 和 > 99.99 % 序列准确性的共识读段比例分别为 99.9 %、81.4 % 和 59.6 %（图 2b）。我们还分析了 Illumina 平台获得的 V3-V4 序列的准确性，结果显示一个
污水处理厂排放对城市河流中细菌病原体的影响
尽管污水处理厂有效减少了污水中的病原体负荷，但残留病原体通常存在于处理后的出水中。使用基于 ONT 的绝对定量，Yang 等人 (2022) 报告出水病原体浓度范围为 1-4 log?? cells/mL（大多约 2 log?? cells/mL），这一范围与我们的发现一致。排放后，残留病原体伴随营养物质进入城市河流，驱动细菌群落的变化，特别是病原体分类群（图 S3b 和图 5）（
结论
本研究证明了 ONT-UMI 方法在受污水处理厂排放影响的城市河流中进行 QMRA 的可行性。首先，使用 NBRC 模拟群落验证了 ONT-UMI 的性能，其显示出与常规 Illumina 测序相当的序列准确性，能够以最小的组成偏差实现可靠的物种检测。将这种验证方法应用于城市河流样本，我们鉴定出了广泛用于 QMRA 的潜在目标病原体。然而，超过 90 % 的
数据可用性
本研究获得的原始序列读段已存入 DDBJ/ENA/GenBank，登录号为 DRR629342-DRR629354，BioProject 号为 PRJDB19957。其他数据可根据要求提供。
CRediT 作者贡献声明
曾杰 (Jie Zeng): 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，方法论，资金获取，形式分析，数据整理，概念化。中井智宏 (Tomohiro Nakanishi): 写作 – 审阅与编辑，资源，方法论，概念化。市来俊介 (Shunsuke Ichiki): 形式分析，数据整理。伊东贞彦 (Sadahiko Itoh): 写作 – 审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这可能被认为影响了本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了 库利塔水与环境基金会 (No. 22E051)、JSPS KAKENHI (No. 22H01626) 和 琵琶湖 - 淀河水質保全機構 的支持。
曾杰 | 中井智宏 | 市来俊介 | 伊东贞彦
