一种用于 100 mL 水样中大肠埃希菌和总大肠菌群计数的显色培养基：根据 ISO 9308-2 对基于 MPN 方法的验证

《Journal of Environmental Management》：A chromogenic medium for the enumeration of Escherichia coli and total coliforms in 100?mL water samples: validation of an MPN-based method according to ISO 9308-2

　　

**摘要**
水质的微生物监测主要依赖于对大肠杆菌的检测和定量，这是国际和欧洲监管框架的要求。在大肠杆菌计数的常用方法中，ISO 9308-2 描述了一种基于最大可能数（MPN）的方法，该方法利用荧光底物 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷检测 β-D-葡萄糖醛酸酶活性。然而，荧光检测需要 365 nm 的紫外光照射，这意味着需要额外的设备，并可能带来职业暴露方面的担忧。在此，针对 100 mL 水样中大肠杆菌和总大肠菌群的 ENUMERA?Coli100 方法作为一种经过验证的 ISO 9308-2 显色替代方案被提出。该方法采用了一种显色葡萄糖醛酸衍生物，在环境光下产生可见的绿色反应，从而消除了对紫外辐射的需求。脱水培养基通过“旋开释放”机制集成到密封瓶盖上，这最大限度地减少了操作步骤，并降低了样品制备过程中的污染风险。使用代表五种基质（饮用水、地表水、废水、再生水和海水）的 120 个水样，针对 ISO 9308-2 评估了该方法的性能。两种方法在所有基质中对大肠杆菌和总大肠菌群的测定结果在统计学上均等效。ENUMERA?-Coli100 表现出 100% 的灵敏度，与 ISO 9308-2 相当的高特异性和选择性，极佳的线性，低检出限和定量限，以及令人满意的准确度。验证按照 ISO 16140-2 和 ISO 13843 标准进行。ENUMERA?-Coli100 构成了水样中大肠杆菌和总大肠菌群计数的一种稳健、可靠且操作实用的替代方案，简化了结果解释，提高了实验室安全性， streamlined 工作流程，并消除了紫外检测设备的需求。

**引言**
水的粪便污染仍然是全球公共卫生的主要威胁之一，每年导致数百万例水传播疾病（UN-Water, 2021）。在用于评估这种风险的微生物指标中，大肠杆菌长期以来被视为参考粪便指示菌，因为它与温血动物粪便污染有特定关联，且适合基于培养的日常检测（Baudi?ová, 1997; Dufour et al., 1981）。作为大肠菌群的成员，其定义为能够发酵乳糖并表达 β-半乳糖苷酶活性，大肠杆菌可以通过其组成型产生的 β-D-葡萄糖醛酸酶与其他大肠菌群细菌区分开来，这种酶活性在很大程度上是大肠杆菌在肠杆菌科中特有的（Blanch et al., 2007; Feng and Hartman, 1982）。这种生化差异是现代荧光和显色方法检测水中大肠杆菌的基础。

目前可用的检测水中大肠杆菌的主要国际标准方法包括 ISO 9308-1（国际标准化组织，2014），基于膜过滤法，适用于背景菌群低的水；ISO 9308-2，基于使用多孔托盘的最大可能数（MPN）格式，适用于多种水型，包括浑浊和负载重的样品（国际标准化组织，2012）；以及 ISO 9308-3，基于微型液体培养基格式，旨在用于地表水和废水，特别是含有高悬浮物的水，但不适用于饮用水（国际标准化组织，1999）。在这些标准中，ISO 9308-2 已成为日常微生物水质评估中最广泛采用的方法之一。该方法规定了一种选择性培养基，含有两种定义底物：邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷（ONPG），被大肠菌群细菌的 β-半乳糖苷酶水解产生黄色；以及 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），被大肠杆菌的 β-葡萄糖醛酸酶水解释放荧光 4-甲基伞形酮，可在 365 nm 紫外光照射下检测到。同时，培养基的组成描述相对宽泛且非特异性，从而允许配方有相当大的变化。在欧洲监管框架内，关于人类饮用水质的欧盟饮用水指令（2020/2184）、欧盟关于水回用的最低要求（2020/741）以及欧盟关于 bathing water 质量管理的指令（2006/7/EC）及其国家转化，要求使用标准化方法对大肠杆菌进行计数，如 ISO 9308-1 和 ISO 9308-3。尽管并非所有这些法规都明确规定 ISO 9308-2，但该方法是全世界公认和使用的 ISO 标准，用于饮用水、再生水和其他受监管水基质的微生物评估。在这方面，ISO 9308-2 当前的措辞被一些作者认为与某些定义底物商业系统的特性密切吻合，同时仍然允许在适用的监管框架内验证替代等效方法（Boubetra et al., 2011）。

已经开发了许多培养基和测试格式用于检测和计数大肠杆菌，其中许多依赖于荧光底物来检测 β-葡萄糖醛酸酶活性（Olstadt et al., 2007）。虽然这些系统分析上稳健，但依赖紫外光照射进行结果解释引入了额外的设备需求、维护需求和日常实验室使用中的实际限制。相比之下，基于靛蓝衍生物的显色底物，如 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷（X-Gluc），在 β-葡萄糖醛酸酶水解后在环境光下产生可见的蓝绿色沉淀，从而提供了对荧光检测的有吸引力的替代方案（Blackburn et al., 2023; Fricker et al., 1997; Manafi, 2000; Olstadt et al., 2007）。这一原理已成功应用于固体培养基和液体 MPN 格式。特别是 AquaCHROM ECC 方法证明了非琼脂基显色培养基可以在无需基于 UV 读取的情况下提供 100 mL 水样中大肠菌群和大肠杆菌的检测和计数，从而代表了在日常水分析中开发实用显色替代方案的重要先例（Blackburn et al., 2023）。然而，仍有空间开发将显色检测与更高的操作简便性、封闭系统处理以及与 ISO 9308-2 分析工作流程直接兼容性相结合的方法。

在基于最大可能数（MPN）方法的过程中，另一个需要考虑的重要方面是该方法的固有统计性质。与直接计数技术不同，MPN 方法根据在定义体积的多个分析室（孔）中孵育后获得的阳性和阴性生长反应分布来估计样品中微生物的浓度。最终浓度是通过将观察到的阳性孔模式与标准化概率表或数学算法进行比较来计算的。因此，估计的 MPN 值强烈依赖于分配给每个分析孔的名义体积。即使孔体积存在微小差异，尽管阳性和阴性孔的模式相同，也可能导致计算的 MPN 变化。这种效应在大微生物浓度下变得特别相关，此时大部分孔为阳性，统计计算变得对室体积的微小变化越来越敏感。在这些条件下，假设分析体积的相对较小差异可能会产生估计 MPN 值的明显差异，即使观察到的生长分布保持不变（McBride, 2003）。

基于之前在快速病毒指标检测方面的经验（Pascual-Benito et al., 2024），针对 100 mL 水样中大肠杆菌和总大肠菌群的 ENUMERA?-Coli100 方法被开发为一种符合 ISO 9308-2 描述的工作流程的显色液体 MPN 方法。该方法采用了一种显色液体培养基（Aquacoli），其中 β-半乳糖苷酶活性产生指示总大肠菌群的黄色，而 β-葡萄糖醛酸酶活性在环境光条件下产生对大肠杆菌特异性的可见绿色，从而消除了对基于紫外结果解释的需求。该系统还集成了一种封闭的试剂盖装置，能够在样品瓶内直接无菌重悬脱水培养基，简化了处理程序并最大限度地减少了样品操作。定量是使用专有的 95 孔 ENUMERA? 托盘进行的（Pascual-Benito et al., 2024），旨在为 100 mL 样品提供广泛的分析工作范围。托盘几何形状和相应的 MPN 表是专门一起设计的，以确保物理配置与用于计数的统计估算模型之间的内部一致性。本研究旨在通过评估 ENUMERA?-Coli100 方法在五种生态和分析上不同的水基质中的灵敏度、选择性、特异性、准确度、线性以及检出限和定量限，来验证其作为 ISO 9308-2 参考方法替代程序的等效性。方法性能按照 ISO 16140-2（国际标准化组织，2016）和 ISO 13843（国际标准化组织，2017）建立的原则和要求进行评估。

**节选片段**
**水基质和样品制备**
研究包括五种水基质：饮用水、地表水、再生水、废水和海水。饮用水由从当地零售商购买的瓶装矿泉水组成，以避免残留氯的干扰。地表水收集自 Llobregat 河下游（西班牙加泰罗尼亚）。再生水和废水分别从一个市政污水处理厂收集，经过三级和二级处理后，该厂服务于...

**水基质**
处理 120 个样品后，117 个样品成功定量了大肠杆菌，而总大肠菌群的样品数量减少到 102。对于大肠杆菌，两个饮用水样品因加标不足被排除，而一个废水样品被丢弃，因为其浓度超过了 MPN 方法的定量范围，导致所有试管均为阳性读数。对于总大肠菌群，八个饮用水样品和十

**讨论**
本研究提供了 ENUMERA?-Coli100 方法作为替代 MPN 方法的内部验证和方法比较评估，用于在 100 mL 水样中同时计数大肠杆菌和总大肠菌群。
该方法的意义不仅在于其与 ISO 9308-2 的分析等效性，还在于实现这种等效性的方式。参考标准基于液体培养基中的 MPN 方法，结合差异性底物反应和...

**结论**
ENUMERA?-Coli100 方法是一种经过验证的替代方法，用于在 100 mL 水样中基于 MPN 同时计数大肠杆菌和总大肠菌群，以替代 ISO 9308-2。在本研究中，该方法在饮用水、地表水、再生水、废水和海水中显示出与参考程序的完全分析可比性。灵敏度为 100%，选择性和特异性与参考方法完全一致，定量性能在相对...

**CRediT 作者贡献声明**
Anicet R. Blanch: 概念构思，调查，方法论，监督，验证，撰写 – 初稿，撰写 – 回顾与编辑。Ariadna Jorba: 形式分析，调查，方法论。Julia Martín-Díaz: 形式分析，监督，撰写 – 回顾与编辑。Miriam Pascual-Benito: 调查，验证，撰写 – 回顾与编辑。Raquel Casas-Mangas: 形式分析，方法论。Helga Nú?ez-Chapela: 形式分析，方法论。Javier Méndez: 数据整理，

**资金**
这项工作由研究小组自己的机构资源资助，通过巴塞罗那大学，加泰罗尼亚，西班牙的 Fundació Bosch i Gimpera 管理。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这可能影响本报告的工作。

Anicet R. Blanch|Ariadna Jorba|Julia Martín-Díaz|Miriam Pascual-Benito|Raquel Casas-Mangas|Helga Nú?ez-Chapela|Javier Méndez|Daniel Asensio
遗传学、微生物学与统计学系，生物学院，巴塞罗那大学，Diagonal 643，巴塞罗那，08028，西班牙